动物转基因和生物反应器综合课件第5章动物转基因方法.pptVIP

*精子介导法直接以精子为载体的转基因方法。将成熟精子与外源DNA共培养，成熟精子与外源DNA预培养之后，使精子有能力携带外源DNA进入卵子中，使之受精，并使外源DNA整合到染色体中。*发展历史1971年，Brackett等人证明去掉精清的兔精子能够与DNA结合，并将SV40的DNA转移到卵中，生产出转基因胚胎.1989年，Sparafora等人首次报道路用精子介导法生产出转基因小鼠.1999年，Perry等人发表了另一种由精子介导转移DNA的方法.*作用机理1999年，Perry创建的精子介导转移DNA的方法DNA精子培养将精子头部注入成熟卵母细胞单精子受精1999年Perry等人发表了另一种由精子介导转移DNA的方法。其具体技术是，用DNA和破坏了外膜的精子进行共培养，然后将精子头部注入成熟卵母细胞，进行单精子受精。用这种方法，他们生产出许多转基因小鼠，转基因效率很高。表3.19列出了他们的实验结果。从表3.19中可以看出，注射携带外源DNA的单精子，可以得到很高比例的转基因胚胎，其转基因效率明显超过原核胚显微注射。但是，这些胚胎中仍然存在着许多嵌合体，即使是表面看起来所有细胞都表达标记基因。在同一实验中，Perry等人将单精注射发育成的胚胎，随机地选取了一部分进行移植，检验胚胎发育成仔鼠后转基因的比例，其结果见表3.20。从表3.20中的数字可以看到，虽然在桑椹胚和囊胚阶段检查时，有50%以上的胚胎是转基因的，但发育成仔鼠时转基因个体只有17-21%。这说明在那些表现为阳性的胚胎中仍存在许多嵌合体，胚胎阶段直观选择转基因胚胎并不完全可靠，只能起到富集转基因材料的作用。总之，精子注射是原核胚显微注射的一种替代手段，它的转基因效率高于原核胚显微注射，操作比原核胚显微注射简化，最重要的是它适合于使用分子量大的基因，如酵母人工染色体或细菌人工染色体等。从理论上讲，这个方法适用于所有可以在体外进行胚胎培养的动物。*精子介导法的优点与缺点优点：可重复性好缺点：稳定性低容易出现嵌合体returntotransgenicmethods原理：阳离子脂质体试剂与DNA混合后，形成一种稳定的脂质双层膜复合物，DNA被包裹在中间，这种脂质双层复合物可直接加到培养的细胞中，脂质体粘附到细胞表面并与细胞膜融合，DNA被释放到胞浆中。（四）脂质体介导法胚胎干细胞（embryonicstemcell，ESCs，简称ES或EK细胞。）胚胎干细胞是早期胚胎（原肠胚期之前）或原始性腺中分离出来的一类细胞.它具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。无论在体外还是体内环境，ES细胞都能被诱导分化为机体几乎所有的细胞类型。（五）胚胎干细胞法（ES细胞法）/Play/show/id/426838/v_show/id_XMjg3NjMyMTQw.html人类干细胞群胚胎干细胞具有多能性（Pluripotency），特点是可以通过细胞分化(Cellulardifferentiation)成多种组织（所有组织，包括生殖系细胞）的能力，但无法独自发育成一个个体（利用四倍体融合技术可以得到完全由所用ES细胞发育而来的个体）。它可以发育成为外胚层、中胚层及内胚层三种胚层的细胞组织。*ES细胞是早期胚胎的内细胞团经过体外培养建立起来的多潜能细胞系。将携带有外源基因的ES细胞注入到动物的早期胚胎内，可产生嵌合体及转基因动物。它本身是二倍体，能在体外培养，具有高度的全能性，可以形成包括生殖细胞在内的所有组织，并且在不同的培养条件下表现出不同的功能状态。*WoodSA,AllenND,RossantJ,AuerbachA,NagyA.(Non-injectionmethodsfortheproductionofembryonicstemcell-embryochimaeras.Nature，1993，365：87–89**优点：外源基因整合情况的可控性高可预先在细胞水平检测外源基因的拷贝数、定位、表达的水平及插入的稳定性外源基因导入ES细胞的方法多样，细胞鉴定及筛选方便*缺点：ES细胞系建立及培养困难维持ES细胞的未分化及多向分化潜能不易所得个体为嵌合体*目前，胚胎干细胞介导法在小鼠上应用比较成熟，在大动物上应用较晚。returntotransgenicmethods*外源DNA注射到细胞核中，可以有较高的整合率。注射到细胞质的DNA因为与受体基因组结合的机会少，整合率低。哺乳动物常用注射细胞核的方法，但鱼类和两栖类的卵是多黄卵