第五讲的提取原理及提取技术.pptVIP

第1页，共38页，星期日，2025年，2月5日3质粒DNA很多微生物（大肠杆菌、农杆菌和蓝细菌）都含有质粒DNA，主要用于构建基因克隆载体，也可作为分离目的基因和基因表达调控因子的材料。4线粒体和叶绿体DNA这是真核生物特有的染色体外遗传物质，分别含有与呼吸作用和光和作用相关的基因。主要用于分离目的基因。第2页，共38页，星期日，2025年，2月5日植物细胞的化学成分主要有:1水、糖类、蛋白质、脂肪以及核酸是生物体所需的基本成分；2氨基酸是合成蛋白质的基本原料；3果胶、纤维素、半纤维素是植物细胞壁的组成成分；4淀粉是光合作用的产物；5金属离子主要用来调节细胞的渗透平衡等，比如钾和钠，镁和锰是叶绿素的成分。第3页，共38页，星期日，2025年，2月5日植物总DNA提取原则保证DNA结构的完整性排除有机溶剂和金属离子的污染蛋白质、多糖、酚类等降低到最低程度排除其他核酸分子的污染第4页，共38页，星期日，2025年，2月5日植物DNA提取的基本原理DNA特点：DNA是极性化合物，溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂。在酸性溶液中，DNA易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。DNP在盐溶液中的溶解度随着盐浓度的增加而增加。第5页，共38页，星期日，2025年，2月5日植物DNA提取的基本原理DNA提取基本步骤：1细胞裂解和DNA的溶解主要任务：破碎细胞并对DNA实施保护。采取措施：⑴利用液氮研磨，使酶失活；⑵快速加入缓冲液并迅速混匀，对细胞溶浆中DNA进行保护。第6页，共38页，星期日，2025年，2月5日EDTA—螯合DNA酶的辅助因子Mg2+和Ca2+,使DNA酶活性降低；SDS—使蛋白质变性并降解蛋白质，也可降低DNA酶的活性；抗氧化剂—降低酚类氧化对DNA的干扰；PVP—与多酚形成复杂的聚合体，与多糖结合，有效去除多糖；。。。。。。第7页，共38页，星期日，2025年，2月5日植物DNA提取的基本原理2与核酸结合的蛋白质及RNA等杂质的去除；主要利用DNA与蛋白质、多糖等在生化性质上的差别，通过加入离子变性剂，去污剂使蛋白质或多糖变性，核蛋白解聚。CTABSDS第8页，共38页，星期日，2025年，2月5日除蛋白质氯仿/异戊醇抽提（氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机相的分离；异戊醇则有助于消除抽提过程中出现的气泡）。使用变性剂变性（SDS、异硫氰酸胍等）高盐洗涤(当溶液中的中性盐的浓度大于1mol/L时，蛋白质会沉淀析出.)蛋白酶处理第9页，共38页，星期日，2025年，2月5日除多糖高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体积的5MNaCl，高盐可溶解多糖。用多糖水解酶将多糖降解。在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积)，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖。第10页，共38页，星期日，2025年，2月5日除酚类物质在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：β-巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等加入易与酚类结合的试剂：如PVP、PEG(聚乙二醇)，它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNA的结合第11页，共38页，星期日，2025年，2月5日除各种离子70％的乙醇洗涤注意：我们在提取某种植物DNA时，需要考虑以上各种杂质的存在，根据某种植物DNA的具体情况采取相应的去除杂质的方法。第12页，共38页，星期日，2025年，2月5日植物DNA提取的基本原理3DNA的沉淀和纯化沉淀：无水乙醇TE缓冲液(10mmol/LTris-HCl,1mMEDTA.pH8.0）作用：①TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase②PH值为8.0，可防止DNA发生酸解第13页，共38页，星期日，2025年，2月5日DNA的纯化技术琼脂糖凝胶电泳洗脱法主要用于小剂量DNA的纯化和酶切片段的回收。1DNA样品在琼脂糖凝胶电泳分带后，切取含有待纯化DNA带的琼脂糖凝胶电泳块，装入透析袋中；2透析袋中加入适量经稀释的电泳缓冲液，并置于稀释的电泳缓冲液中电泳1-2h，使DNA脱离琼脂糖凝胶；第14页，共38页，星