激光扫描共聚焦显微镜.pptVIP

激光扫描共聚焦显微镜第1页，共32页，星期日，2025年，2月5日激光扫描共焦显微镜的设计特点:1.点照明,具有照明pinhole和探测pinhole2.照明pinhole和探测pinhole共轭(共焦),共焦点即被探测点，被探测点所在的平面为共焦平面3.具有扫描系统——逐点扫描成像4.激光作为光源5.具有多个（四个）荧光通道，可同时探测多个被标记物第2页，共32页，星期日，2025年，2月5日FluorescentMicroscopeObjectiveArcLampEmissionFilterExcitationDiaphragmOcularExcitationFilterObjectiveLaserPinholeExcitationPinholePMTEmissionFilterExcitationFilterConfocalMicroscope第3页，共32页，星期日，2025年，2月5日人眼分辨率： 0.2mm光学显微镜分辨率：0.25mm电子显微镜分辨率：0.2nm共焦显微镜分辨率：0.18mm第4页，共32页，星期日，2025年，2月5日电子显微镜的缺点：1.由于样品需要固定,观测活细胞十分困难.2.样品制备过程（固定、包埋、切片）造成的假象荧光显微镜的缺点:1.无法实现对荧光,透射光的同时采集,无法实现多荧光的同时采集2.荧光散射光太强，造成实际分辨率的大大下降。3.荧光漂白很快，使荧光图像的拍照有困难。4.无法对样品进行断层扫描,完成3D的工作.5.对于信号较弱的样本,无法提高观察的灵敏度.6.可以观查活细胞或组织但细胞或组织内结构高度重叠第5页，共32页，星期日，2025年，2月5日激光共聚焦显微镜的应用单、双、三,四色标记检测。精确的一、二、三、四维观察。高品质的荧光成像、透射成像、物体表面反射成像。静态和动态观察(CA2+,pH,膜电位,膜流动性等)。定性以及定量分析。光谱扫描,ROI扫描.特殊的光反应(FREP,FRAP,CAGED-UNCAGED等)。第6页，共32页，星期日，2025年，2月5日时间分辨和快速扫描动态图像出色的反射光图像明场，DIC,相差和透射光图像单标，双标和三标图像激光共聚焦显微成像技术的应用第7页，共32页，星期日，2025年，2月5日一.定位、定量免疫荧光标记（单标、双标或三标）的定位、定量如：细胞膜受体或抗原的分布，微丝、微管的分布、两种或三种蛋白的共存与共定位、蛋白与细胞器的共定位、干细胞的分化细胞凋亡:AnnexinV-fitc+PI末端原位杂交-fitc+PI荧光原位杂交：染色体基因定位单细胞凝胶电泳GFP的表达活细胞或活体组织静息游离Ca2+的分布与定量活细胞内pH的定量、膜电位的测量活细胞内自由基水平的定量第8页，共32页，星期日，2025年，2月5日Helagreen-中心体red-纺锤体Immuno-fluorecencelabel第9页，共32页，星期日，2025年，2月5日二.光学切片和三维重组光学切片和三维重组:LSCM通过薄层光学切片功能，可获得标本真正意义上的三维数据，经计算机图像处理及三维重建软件，产生生动逼真的三维效果，可进行形态学观察，并揭示亚细胞结构的空间关系，用以阐明三维结构与组织功能之间的关系。第10页，共32页，星期日，2025年，2月5日显微CT与三维重组第11页，共32页，星期日，2025年，2月5日3Dreconstruction第12页，共32页，星期日，2025年，2月5日三.动态测量游离Ca2+,Mg2+、K+、Na+测量pH值的检测自由基的检测第13页，共32页，星期日，2025年，2月5日相对测量程序化测量：用timelapse中的编程按钮可进行不同时间序列的扫描测量 ?F/F=(F-Fbase)/(Fbase-FBG)第14页，共32页，星期日，2025年，2月5日四.细胞膜电位的测量标记膜电位探针(慢反应）：JC1510nm 530/590nmDioc5(3)548nm 573nmDioc6(3)