克隆基因表达及基因干扰-修.pptxVIP

克隆基因的表达及基因干扰北京协和医院检验科吴洁1

克隆基因的表达及基因干扰2第一节外源基因的表达第三节基因表达干扰技术第二节表达产物的分离、纯化与鉴定

克隆基因的表达及基因干扰3第一节外源基因的表达01第二节表达产物的分离、纯化与鉴定02第三节基因表达干扰技术03

基因表达遗传信息从DNA到蛋白质的传递过程——中心法则（centraldogma）。第一节外源基因的表达

第一节外源基因的表达501外源基因在宿主细胞中表达。02外源基因03表达载体04重组载体05导入宿主细胞06在宿主细胞中表达出蛋白质07提取蛋白08宿主细胞：09原核细胞或真核细胞。10克隆基因表达

第一节外源基因的表达6原核生物表达体系真核生物表达体系酵母，哺乳动物细胞大肠杆菌

一、原核生物表达体系7原核表达载体具有的特点对外源目的基因的要求包涵体真核生物基因在原核细胞中的表达

对外源目的基因的要求一、原核生物表达体系8不应具有5′端非编码区以及内含子结构01不能直接用真核基因组DNA.02常以cDNA为模板，设计引物，PCR扩增目的基因.03

一、原核生物表达体系9选择标志启动子：乳糖启动子lac，色氨酸启动子trp等翻译调控序列，如核糖体结合位点(SD序列)，及翻译起始点和终止序列多克隆位点(MCS)（二）原核表达载体具有的特点原核启动子SD序列MCS终止子

TTGACA原核启动子10A大肠杆菌的所有启动子中都有两段一致序列：B35box和-10box（Pribnowbox）

consensussequences11

核糖体结合位点（ribosomebindingsite,RBS）Shine-Dalgarno（SD）sequence：mRNA上与核糖体16sRNA结合的序列。SDmRNA5’—AGGAGGU——AUG——16SrRNA3’UCCUCCAS-D序列距离AUG的距离也影响翻译

1.非融合型表达蛋白13融合型表达蛋白真核生物基因在原核细胞中的表达分泌型表达蛋白原核生物表达体一、原核生物表达体系1.非融合型表达蛋白载体表达出的外源基因蛋白质不与细菌的任何蛋白 质融合在一起。优点：表达的非融合蛋白与天然状态下存在的蛋 白在结构、功能以及免疫原等方面基本一致缺点：易被细菌蛋白酶破坏（三）真核生物基因在原核细胞中的表达SD序列ATG-外源基因-TAG14

常用的非融合型表达蛋白原核表达载体pKK223-3一、原核生物表达体系15抗氨苄青霉素基因tac启动子(trp-lac)SD序列AUG起始密码转录终止序列T1和T2

一、原核生物表达体系16融合型表达蛋白优点：表达出的外源基因产物蛋白是与质粒载体上的菌体蛋白连接在一起的。具有抗原性可作为抗原，可以抵御细菌蛋白酶的破坏。便于融合蛋白的分离和纯化。

融合型表达系统主要有一、原核生物表达体系1701GST系统02His系统03金黄色葡萄球菌蛋白A系统04β-半乳糖苷酶系统05麦芽糖结合蛋白系统

GST系统pGEX系列18①启动子：tac②操纵基因：lacP③调节基因：lacI④S-D序列⑤ori：pBR322ori⑥融合肽：GST(谷胱甘肽巯基转移酶）1、载体组成结构:lacItaclacOS-D/ATGGST插入位点TGAlacP

GST系统pGEX系列GST融合蛋白用GlutathioneSepharose亲和层析柱分离纯化。2、产物提纯:3、产物分离:用凝血酶或Xa因子可以把外源蛋白从GST上切下来。柱（column）GST外源蛋白凝血酶外源蛋白柱（column）GSTGST洗脱柱（column）可再利用＋19

His系统20His-tag（组氨酸标签）：His-tag能与Ni2+柱结合，但很容易被咪唑（或EDTA溶液）洗脱下来，可以纯化蛋白质。在外源多肽的N端或C端接上6个组氨酸（6×His）

一、原核生物表达体系223.分泌型表达蛋白载体表达出的外源蛋白质与细菌的分泌信号肽连在一起，可被宿主菌分泌到细胞外。pINIII系列载体pINIII-comA1,pINIII-comA2,pINIII-comA3,IpplacPlacOS-D/ATGompa插入位点

一、原核生物表达体系23包涵体(inclusionbody)大肠杆菌高效表达外源基因时形成的膜包裹的高密度、不溶性和无活性的蛋白质颗粒。0201

一、原核生物表达体系241.包涵体的形成2.包涵体的分离与纯化3.包涵体的复性（四）包涵体(inclusionbody)

1.包涵体的形成251表达产率过高，