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目录CONTENTS01质粒准备02细胞培养体系03转染操作流程04病毒收集处理05病毒纯化方法06质量检测验证

01质粒准备

目的基因克隆构建根据目的基因的特性，选择合适的克隆载体进行基因克隆。选择合适的克隆载体通过特定的酶切位点，将目的基因插入克隆载体中，构建重组质粒。目的基因插入载体利用测序等方法，验证目的基因是否正确插入克隆载体中。重组质粒验证

载体质粒浓度测定评估质粒质量通过电泳等方法，评估质粒DNA的完整性，确保无降解或污染。03使用分光光度计或荧光计等仪器，测定质粒DNA的浓度，确保满足后续实验需求。02测定质粒浓度提取质粒DNA使用专业的质粒提取试剂盒，从细菌中提取出载体质粒DNA。01

质粒稀释与分装标准质粒稀释根据实验需求，将质粒DNA稀释至适当的浓度，以提高转染效率。01分装保存将稀释后的质粒DNA分装到无菌的离心管中，保存于适当的温度下，避免反复冻融和污染。02质量控制在质粒稀释与分装过程中，需进行严格的质量控制，确保每批质粒的稳定性和一致性。03

02细胞培养体系

293T细胞系复苏从液氮中取出293T细胞，迅速放入37℃水浴中快速解冻，然后转移到含有完全培养基的离心管中。细胞复苏操作细胞悬液制备培养条件控制离心去除冻存液中的DMSO，加入新鲜培养基重悬细胞，并调整细胞密度。将复苏的细胞接种在培养皿中，置于37℃、5%CO2的培养箱中进行培养。

选用适合293T细胞生长的基础培养基，如DMEM或RPMI1640。基础培养基选择在基础培养基中添加一定比例的胎牛血清，为细胞提供生长所需的营养物质。血清添加加入适量的抗生素和抗真菌剂，防止细胞污染。抗生素和抗真菌剂培养基优化配置

细胞传代同步处理细胞生长状态观察细胞计数与接种细胞传代操作定期观察细胞生长状态，当细胞达到80%-90%融合时进行传代。弃去旧培养基，用PBS轻轻洗涤细胞，然后加入适量胰酶消化细胞，待细胞脱落后加入新鲜培养基终止消化。将消化后的细胞进行计数，并按照一定密度接种到新的培养皿或培养板中，继续进行培养。

03转染操作流程

转染试剂选择标准高效性选择具有高转染效率的试剂，确保细胞能够高效地吸收和表达外源基因。01细胞毒性低试剂对细胞生长和代谢的影响小，尽可能避免对细胞造成损伤。02稳定性好试剂在储存和使用过程中不易失活或降解，保证转染效果的稳定性。03适用范围广能适用于多种细胞类型和多种质粒类型的转染。04

质粒混合比例控制根据细胞类型和转染试剂的说明，合理调整质粒的浓度，避免浓度过高或过低影响转染效果。质粒浓度比例优化混合均匀根据目的基因表达的需求，优化质粒的混合比例，确保目的基因能够高效表达。将质粒混合均匀，避免出现沉淀或团聚现象，影响转染效率。

细胞密度在细胞密度适中时进行转染，避免细胞过密或过疏影响转染效果。转染时间参数设定转染时长根据细胞类型和转染试剂的说明，合理设定转染时长，确保质粒能够充分进入细胞并表达目的基因。时间选择选择细胞生长旺盛期进行转染，避免细胞处于静止期或衰退期影响转染效果。

04病毒收集处理

培养液离心过滤通过离心将细胞碎片从病毒培养液中分离出来，提高病毒纯度。去除细胞碎片采用过滤技术，如滤膜过滤，进一步去除病毒培养液中的杂质和颗粒物。过滤杂质使用超滤或超离心等方法对病毒进行浓缩，提高病毒浓度。浓缩病毒

病毒上清分装保存标记信息在分装容器上标记病毒种类、浓度、体积、日期等信息，以便追踪和管理。03根据病毒种类和用途，确定每个容器的分装体积，便于后续使用。02分装体积分装容器选择选择无菌、密封性好的容器进行分装，如离心管、冻存管等。01

冻存温度与时效冻存温度根据病毒种类和稳定性，选择合适的冻存温度，如-20℃、-80℃等。01冻存时效确定病毒在所选冻存温度下的稳定保存时间，避免病毒失活或降解。02冻存容器选择能够承受所选冻存温度和压力的容器，如冻存盒、冻存架等。03

05病毒纯化方法

超速离心浓缩步骤将感染病毒的细胞培养液收集起来，采用适当的方法破碎细胞，释放病毒。样品准备离心去除杂质病毒浓缩通过超速离心，将细胞碎片、杂质等固体物质与病毒分离。将离心后得到的上清液进行超速离心，使病毒颗粒沉淀在离心管底部，达到浓缩的目的。

层析柱纯化流程选择层析柱根据病毒的特性和纯化需求，选择合适的层析柱进行纯化。上样与洗脱收集纯化病毒将浓缩后的病毒样品通过层析柱，使病毒与层析柱中的填料结合，然后用适当的洗脱液将病毒从填料上洗脱下来。将洗脱下来的病毒收集起来，进行下一步的纯化或检测。123

透析缓冲液置换透析袋处理透析后处理缓冲液置换将纯化后的病毒装入透析袋中，透析袋的截留分子量要小于病毒颗粒的大小。将透析袋放入盛有缓冲液的容器中，通过透析作用将病毒中的盐分、小分子杂质等去除，同时达到缓冲液置换的