生物化学芜湖刘宽辉82课件.pptx

生物化学芜湖职业技术学院教师：刘宽辉BIOCHEMISTRY

核酸的变性复性

3核酸的变性和复性1变性(denaturation):加热或某些试剂处理时，DNA中碱基间氢键断裂和相邻碱基间的堆集力受到破坏,有规则的双螺旋结构逐渐变为近似无规则线团，也称熔解。降解:核酸骨架上的3’，5’-磷酸二酯键的断裂为降解。

4◆变性种类：

热变性、

酸变性、

碱变性(pH=11.3时氢键均断裂)、

变性剂(尿素,甲酰胺等)、

盐浓度低于0.01Mol/L时静电斥力使可配对的碱基无法靠近。

5◆变性后表现:

DNA变为“线团”故粘度下降,生物活性降低，沉降速度加快。RNA的粘度比DNA粘度小。

DNA变性时其一级结构不改变,空间结构(三维结构构象)，双螺旋结构破坏

增色效应:核酸变性后，增加了A260的光吸收。

6◆DNA的熔解温度(Tm):

通常把DNA的双螺旋结构失去一半时的温度,或A260增加到最大增值的一半时的温度称DNA的熔点,或熔解温度.用Tm表示。DNA的Tm值一般在70-85℃之间。

变性的过程通常是一个跃变的过程,发生在一个很窄的温度范围内,一般为6-8℃。

7Tm

影响Tm大小的因素:▽DNA的均一性。均一性越高,DNA熔解温度范围越窄。▽不同来源的DNA的Tm值是不同的，DNA分子中的(G+C)含量与Tm值有关，GC%越高,则Tm值越大。这是由于在DNA分子中，G≡C碱基对特别稳定的原因。G-C%=(Tm-69.3)*2.44,Tm=69.3+0.41*GC%▽介质的离子强度越低,DNA的Tm越低,熔解温度的范围越窄.故DNA制品应保存在较高浓度溶液中.常常在1mol/LNaCl溶液。

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2复性(renaturation)◆变性DNA两条单链在适当条件下,又可使两条彼此分开的链重新缔合,成为双螺旋结构。这一过程称作复性,也称退火(annealing)。◆复性时DNA双螺旋结构中堆积的碱基间的电子相互作用减低了对紫外光的吸收，发生减色效应(A260下降)。

11◆影响复性的因素：

热变性的DNA在缓慢冷却时可发生复性,但迅速冷却时则难以完全复性。

DNA片段越大，复性越慢,

DNA浓度越大，复性越快。

◆复性的条件:

盐溶液浓度：

温度：介质中要有足够的盐浓度以消除磷酸的静电斥力0.15-0.50mol/LNaCl.有足够高的温度以破坏无规则的链内氢键,但又不能太高,否则配对碱基间的氢键难以形成.

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