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方法：pulldown阐述它在靶标确证中的应用

对于参考文献的简单介绍：

文献名称：Chemicaltaggingofadrugtargetusing5-sulfonyltetrazole

作者：SatsukiOtsuki;ShinichiNishimura;Hisae

Takabatake;KozueNakajima;YasuakiTakasu;

ToruYagura;YukiSakai;AkiraHattori;

HideakiKakeya

杂志：BioorganicMedicinalChemistryLetters

：2013Vol.23No.61608-1611

IF:2013:2.331;2012:2.338;2011:2.554;2010:2.661

SCI分区：3区

寻找文献的过程：

进入百链网，在搜索栏中输入“smallmolecule”，检索外文文献，然后在搜索的结

果中再搜索“targetidentification”，浏览搜到的文献选择合适的。

对于文献中研究的小分子和大分子的简介：

CsA（环孢素A）是一种于天然产物的免疫抑制剂，在这里把它制成小分子探针

亲环素A(CyPA)，是我们要确证的靶标，它广泛存在于多种组织和细胞,具有肽基脯氨酰

顺反异构酶(PHase)活性,在一系列生物学过程中发挥重要功能,如蛋白折叠、免疫抑制、与

CD147相互作用以及细胞凋亡等。近年来研究发现,CypA与一些的发生发展存在密切

联系,特别是与肺癌、胰和肝癌等。这里用pulldown技术研究他们相互作用，pulldown

是亲和纯化的一种形式。

小分子和大分子作用原理：

首先将5—磺酰四唑，环孢素A和生物素三者结合制作成探针，其中5—磺酰四唑是标记

功能组，环孢素A是配体，生物素是。这个小分子探针诱饵蛋白。

然后将探针放入到混有链霉珠的细胞裂解液中，三者进行混合孵育，带有的诱饵蛋白

与可以和特异结合的链霉珠结合生成次级亲和支持物用于捕获蛋白，而细胞裂解

液中含有要确证的靶标蛋白。

CsAprobe从细胞裂解液中把和它有亲和力的蛋白捕获在链霉珠上，而探针中的5--

磺酰四唑受到靶标中亲核试剂可以共价结合靶标活性位点，起到一个辅助作用，增强

探针与靶标蛋白作用。这样就获得了靶标，又可以称为捕获蛋白。

再对探针分子和捕获蛋白进行收集洗脱，经SDS分离，鉴定结果是存在目标蛋白，

有18kDA的蛋白质条带被检测到，它们就是通过Westernblotting分析后证实的CyPA。

由此确证了CsA的靶标是CyPA。

为什么这个方法可行的（为什么大分子是小分子的主要作用靶点）：

制成探针，保留原有生物学性质

生物素有效标记，与链霉珠生成亲和物有助于靶标蛋白捕获

缓冲液及样品条件与靶结合相互作用兼容；

诱导蛋白在带有和被时仍可行使功能（CsA，5--磺酰四唑保留原有生物学活性以

高亲和力与CyPA结合）；

5—磺酰四唑中6价S，反应活性高，易受亲和试剂与之共价结合

探针与靶标特异结合相互作用的亲和性足够强，非结合的样品成分被洗脱，进行

SDS

所以，捕获蛋白可以结合到亲和支持物上。

在这里pulldown用于确证小分子和大分子作用，通过查阅其他文献，可知，pulldown还

可以用在大分子和大分子作用还有靶标发现等上。