抗TNF-α纳米抗体在毕赤酵母中表达及发酵条件优化.pdfVIP

大连理工大学硕士学位论文

摘要

肿瘤坏死因子α(TNF-α)是癌症、自身免疫性疾病等多种疾病的关键细胞因子，利

用抗体或抑制剂及时阻断血液中过表达的TNF-α与其受体的结合，抑制下游信号通路

的转导，对此类疾病的治疗具有重要意义。目前的TNF-α抑制剂主要为单克隆抗体类药

物，此类抑制剂不仅生产成本高，而且存在一定的免疫原性，抗TNF-α纳米抗体的出现

为解决上述问题提供了新思路。纳米抗体得益于其免疫原性低、发酵生产简单高效等特

点，在TNF-α抑制剂研究中受到越来越广泛的关注。但是，抗TNF-α纳米抗体的高效

制备技术尚未得到系统性研究。本论文拟选用毕赤酵母为表达宿主，利用其可外泌表达

目的蛋白、分离纯化操作简单等优势，通过序列筛选、高拷贝载体设计和发酵条件优化，

实现抗TNF-α纳米抗体的高效表达制备。具体研究内容如下：

首先，以pGAPZαA为表达载体，在毕赤酵母中表达四条不同的抗TNF-α纳米抗体

序列(Seq1~Seq4)，并以是否正确表达和表达量为指标，筛选出适合毕赤酵母表达的抗

TNF-α纳米抗体序列(Seq4)。为进一步提升该抗TNF-α纳米抗体的表达量，在pGAPZαA-

Seq4基础上构建高拷贝载体pGAPZαA-Seq4-NTS。该载体将纳米抗体表达盒整合到毕

赤酵母基因组中高度重复的rDNA位点，以提高目的基因的拷贝数，从而达到提高表达

量的目的。实验结果表明：与初始抗TNF-α纳米抗体表达的菌株相比，以pGAPZαA-

Seq4-NTS为载体的高拷贝菌株在摇瓶培养阶段将抗TNF-α纳米抗体表达量从43mg/L

提高至54mg/L，产量提高了28%。

为了适应大规模化酵母发酵的成本控制需求，本论文以抗TNF-α纳米抗体表达量

为指标，对BSM、FM22及FMG三种发酵生产中常用的全合成培养基进行筛选。实验

结果表明：FM22为抗TNF-α纳米抗体的更适全合成培养基；在摇瓶培养84h后，抗

TNF-α纳米抗体在BSM、FM22及FMG的表达量分别为23mg/L、61mg/L及42mg/L。

此外，响应面分析结果表明：FM22培养基中(NH)SO、CaSO及PTM1的浓度分别在

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4.5~6.0g/L、0.9~1.4g/L及1.0~3.0mL/L极大范围内，抗TNF-α纳米抗体表达量均高于

其最大值的87%(表达量在42~46mg/L之间)，为工业生产中使用该培养基提供了较高的

加料容错率。

随后，在1.5L发酵罐中对发酵温度、发酵pH及碳源(甘油)补料速率进行优化，并

对碳源批式流加发酵过程进行动力学分析。实验结果表明：30℃、pH5.5及甘油补料速

率为20mL/h/L是最佳的发酵条件，该条件下毕赤酵母的纳米抗体表达量为439mg/L，

较摇瓶培养提高了7倍。抗TNF-α纳米抗体亲和力为83.3nM，Tm值为69℃。

综上所述，本文首次通过高拷贝表达载体设计，筛选得到了对抗TNF-α纳米抗体具

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抗TNF-α纳米抗体在毕赤酵母中表达及发酵条件优化

有高表达量的毕赤酵母菌株，并通过发酵条件优化，实现了抗TNF-α纳米抗体的高效表

达制备，为今后抗TNF-α纳米抗体的大规模发酵生产提供了技术基础。

关键词：抗TNF-α纳米抗体；毕赤酵母；高拷贝载体；蛋白表达；动力学分析