蛋白质纯化技术Lite.pptVIP

二、蛋白质纯化的总原则和纯化步骤步骤选择实验材料，实验材料预处理蛋白质的提取蛋白质的粗分级蛋白质的细分级蛋白质的鉴定第29页，共82页，星期日，2025年，2月5日蛋白质纯化的前期准备关于蛋白质我们已知什么？最好的来源？蛋白质纯度要求？活性要求？纯化蛋白的量？如何进行鉴定？纯化时间长短？最终花费？纯化方案？第30页，共82页，星期日，2025年，2月5日1、选择实验材料及预处理选择实验材料物种的选择组织的选择实验材料预处理液体材料过滤离心固体材料洗涤：自来水—蒸馏水—提取缓冲液材料破碎：第31页，共82页，星期日，2025年，2月5日材料破碎机械剪碎研磨反复冻融法超声破碎法高压匀浆法酶解法第32页，共82页，星期日，2025年，2月5日2、蛋白质的提取①提取分离原则尽可能多地提取目的蛋白，同时避免活性丢失（温度过高、pH、有机试剂、金属离子、蛋白酶等因素）选择合适的pH、选择合适的离子强度第33页，共82页，星期日，2025年，2月5日2、蛋白质的提取②提取液成分的确定pH缓冲液：Tris-HCl,Tris-Gly,Gly-HCl,柠檬酸-柠檬酸钠…离子：动物NaCl,植物KCl还原剂:DTT…蛋白酶抑制剂：EDTA,PMSF…金属离子螯合剂:EDTA,EGTA…去污剂:SDS,CHAPS,TritonX-100,Tween-20甘油③温度0~4℃第34页，共82页，星期日，2025年，2月5日3、蛋白质的粗分级（粗提）使用蛋白质提取缓冲液提取实验材料后，蛋白提取液中目标蛋白质的浓度往往较低，采取一些简单的方法使目标蛋白质浓缩，同时去除大量的杂质。常用的实验技术：沉淀法（盐析、有机溶剂沉淀、等电点沉淀）、超速离心、透析、超滤…第35页，共82页，星期日，2025年，2月5日4、蛋白质的细分级粗分级只是使蛋白质得到浓缩和初步分离纯化，多数情况下还要根据蛋白质分子大小、分子形状、分子表面特征或分子带电状况进一步纯化。常用的实验技术：层析第36页，共82页，星期日，2025年，2月5日4.1.层析（chromatography）固定相：凝胶流动相：缓冲液原理：第37页，共82页，星期日，2025年，2月5日凝胶介质PharmaciaBioGelAagaroseBioGelPacrylamideBio-RadSephadexglucose(dextrose)SepharoseagaroseSephacrylglucose+acrylamideSephacelcellulose第38页，共82页，星期日，2025年，2月5日层析装置（Chromatographicequipment）蠕动泵层析柱检测器记录仪部分收集器第39页，共82页，星期日，2025年，2月5日①②③第40页，共82页，星期日，2025年，2月5日第41页，共82页，星期日，2025年，2月5日4.1.层析（chromatography）分子筛层析（Gelfiltration）离子交换层析（Ionexchange）疏水作用层析（Hydrophobicinteraction）亲和层析（Affinity）第42页，共82页，星期日，2025年，2月5日4.1.1分子筛层析（Gelfiltration）原理也称为凝胶过滤、排阻层析。是以多孔凝胶材料为支持物，当蛋白质溶液流经此支持物时，分子大小不同的蛋白质所受到的阻滞作用不同而先后流出，从而达到分离纯化的目的。凝胶介质葡聚糖（glucose）琼脂糖（agarose）聚丙烯酰胺（acrylamide）纤维素（cellulose）第43页，共82页，星期日，2025年，2月5日分子筛层析

GelfiltrationchromatographyHydrophilicNospontaneousbindingtoproteins.ChemicallyandphysicallystableRigidtoallowahighlinearflow-rate亲水对蛋白质亲和力低物理化学性质稳定流速稳定第44页，共82页，星期日，2025年，2月5日分子筛层析

Gelfiltrationchromatography第45页，共82页，星期日，2025年，2月5日分子筛层析