原料乳中嗜冷菌快速检测新技术研究进展江苏食品药品09课件.pptxVIP

原料乳中嗜冷菌快速检测新技术研究进展江苏食品药品职业技术学院

嗜冷菌是指在7℃及以下可生长的微生物，其种类繁多，在原料乳中最常见的嗜冷菌是革兰氏阴性的假单胞菌属(Pseudomonas)和革兰氏阳性的杆菌属(Bacillus)。嗜冷菌对原料乳品质和货架期有很大影响，挤奶设备的不彻底清洗和消毒被认为是引起嗜冷菌污染的主要原因之一。虽然嗜冷菌在巴氏杀菌和UHT灭菌阶段能够被完全杀死，但是其在生长繁殖过程中产生了热稳定性的蛋白酶和脂肪酶，这些酶在热处理之后仍能残留一定活性，在乳制品储藏过程中不断分解蛋白质和脂肪，最终导致乳制品出现苦味、腐烂味等风味异常。此外，某些嗜冷菌属能够产生毒素或者具有抗药性而被认为是机会致病菌。

因此，嗜冷菌污染是影响乳品工业发展的重要因素，快速准确地检测原料乳中嗜冷菌含量对提高乳制品品质，加强企业经济效益有战略意义。国际标准中嗜冷菌的测定方法是将原料乳在6.5℃下培养10d计数，该方法能够准确计数但是耗时过长。随着微生物技术的不断发展，化学方法、免疫技术、分子基因技术、物理方法等技术被应用到微生物的快速检测中，其中大都适用于乳制品微生物的检测。这些新兴技术的出现大大缩短了检测时间，为乳制品企业及时有效地了解乳中嗜冷菌含量提供了依据。

1嗜冷菌快速检测方法国内外对嗜冷菌的快速检测建立了许多方法(见表1)，这些方法不断被优化改进以求达到工业化应用的目的。然而刚采集的新鲜原料乳中初始嗜冷菌占细菌总数的10%～50%，在低温冷藏过程中再逐渐占据主导地位。一些快速检测方法(如氨肽酶法、电阻抗法、ELISA、QCM等)检测阈值较高，菌数达到104cfu/mL以上才能被检出，不能第一时间得到新鲜生乳中的嗜冷菌含量。DEFT法近些年来少有报道，且在103cfu/mL以上才有较好线性关系。而脂肪酶活法受到乳中游离脂肪酸等因素影响，与嗜冷菌的相关性仍有待研究。因此，本文将重点介绍其中几种近些年来发展较快，低检测阈值且快速省时的嗜冷菌检测技术。

1嗜冷菌快速检测方法

1嗜冷菌快速检测方法1.1实时定量PCＲ实时定量PCＲ(Ｒeal－timeQuantitativePolymeraseChainＲeaction，ＲQ－PCＲ)是在常规PCＲ体系中加入荧光染料或荧光探针，实现对PCＲ反应过程的实时监测和累加荧光信号的同步分析，从而克服了传统PCＲ只能基于凝胶电泳定性判断的缺点。很多研究表明该方法检测限与平板计数法相近，例如对原料乳中类芽孢杆菌属(Paenibacillusspp.)定量分析，其检测限约为3.25×101cfu/mL;而对污染奶样中单增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)的PCＲ定量检测限可达1.58×103cfu/mL。

1嗜冷菌快速检测方法1.1实时定量PCＲ目前ＲQ－PCＲ趋于更加节约时间和成本，在单一反应中进行复合PCＲ扩增成为研究趋势。Machado等人针对不同目标基因设置了各自的特异性引物，对原料乳中不动杆菌属(Acinetobacter)，荧光假单孢菌属(P.fluorescens)，嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)和沙雷氏菌(Serratia)进行复合PCＲ探索分析，凝胶电泳结果可清晰区分4条不同长度的DNA链，表明在原料乳中同时检测这四种细菌的可操作性。

1嗜冷菌快速检测方法实时的复合PCＲ技术通常采用含有不同荧光素的特异性探针在扩增时进行同步监测，而荧光染料不能特异性区分不同DNA片断，需通过后续的融化曲线分析来克服此问题。Omiccioli等人比对了荧光探针复合PCＲ和融化曲线分析两种方法来同时检测奶样中沙门氏菌(Salmomellaspp.)、单增李斯特菌和大肠杆菌O157(EscherichiacoliO157)，结果显示虽然荧光探针复合PCＲ在检测培养基样品时更为灵敏，但两种方法在对奶样检测时达到了同样的检测限:1cfu/125mL。

1嗜冷菌快速检测方法这种技术的出现为原料乳中多种优势嗜冷菌属的同步检测奠定了基础，比对单一菌属的测定来反映嗜冷菌总数更具准确性。但是ＲQ－PCＲ无法区分样品中的DNA是来自活细胞还是死细胞。目前的解决方式是在DNA提取和扩增前先加入一种染料，在该技术中染料EMA或PMA只能进入死细胞破坏其细胞完整性和DNA结构，从而抑制死细胞DNA