细胞融合第四节单克隆抗体的制备21课件.pptx

细胞融合第四节单克隆抗体的制备

融合后细胞培养第四节单克隆抗体的制备筛选选择性培养:HAT培养液H（Hypoxanthine）:次黄嘌呤A（Aminopterin）：氨基喋呤；叶酸拮抗物，阻断DNA合成主要途径T(Thymidine)：胸腺嘧啶核苷；“核苷酸前体”，供细胞通过替代途径合成DNA融合后细胞混合液HAT培养基2weekslaterHT培养基正常培养基1weeklater

融合后细胞培养第四节单克隆抗体的制备B淋巴细胞：HGPRT+，TK+骨髓瘤细胞：HGPRT-，TK-不能长期存活死亡DNA内源性途径(主要途径)谷氨酰胺or单磷酸尿苷酸二氢叶酸还原酶AHT外源性途径(旁路途径)(Hypoxanthineguzninephosphoribosyltransferase)次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)胸腺嘧啶激酶(TK)(Thymidinekinase)外源性途径(旁路途径)HAT培养基筛选杂交瘤细胞：HGPRT+，TK+长期存活

细胞准备第四节单克隆抗体的制备融合后细胞培养Q:到了这一步，获得了什么细胞？下一步要做什么？

筛选阳性克隆与亚克隆第四节单克隆抗体的制备杂交瘤细胞培养7d后，显微镜下观察，正常情况可以看到较小菌落。使用HAT培养基半量换液，防止吹散刚成型的细胞堆。取上清进行抗体检测。

筛选阳性克隆与亚克隆第四节单克隆抗体的制备筛选阳性克隆常用检测方法酶联免疫吸附法(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)间接免疫荧光法(Indirectimmunofluorescence,IFA)要求：简便、快速、敏感;在短时间内能检测大量样品

筛选阳性克隆与亚克隆第四节单克隆抗体的制备抗原第1抗体酶第2抗体待检杂交瘤培养上清液底物有色产物酶标仪检测技术原理：酶联免疫吸附法必备试剂：固相的Ag或Ab----免疫吸附剂酶标记的Ab或Ag----结合物酶反应的底物-------底物方法类型：夹心法间接法竞争法

筛选阳性克隆与亚克隆第四节单克隆抗体的制备酶联免疫吸附法EE终止液标本酶标抗体底物显色显色固相固相标本酶标二抗底物1.夹心法2.间接法3.竞争法Ag※Ag※Ab+AbAg(标本)(定量)AgAb

筛选阳性克隆与亚克隆第四节单克隆抗体的制备免疫荧光法