蛋白质的定性定量分析(1)PPT资料.pptVIP

第二章蛋白质的定性定量分析课件;蛋白质含量的测定方法（重点掌握）;第一章蛋白质的含量测定;蛋白质元素组成的特点;一、紫外光谱(A280)吸收法;原理;优点;计算方法;二、考马斯亮蓝G-250检测法;原理;所需时间;计算方法;三、Lowry检测法;原理;优点;计算方法;四、BCA(二喹啉甲酸)检测法;原理;优点;第二节蛋白质相对分子量测定;一、SDS测定蛋白质的相对分子量;3.SDS基本原理;SDS作用：与蛋白牢固结合，当其浓度大于1mmol/L时，SDS与蛋白质的结合比例为1.4gSDS/1g蛋白质，由于十二烷基硫酸根带负电荷，使得样品中各种蛋白质与SDS形成的SDS-蛋白质复合物都带有相同密度的负电荷，掩盖了蛋白质分子间天然的电荷差异;SDS-蛋白质复合物分子构型也几乎相同(雪茄烟形的长椭圆棒状的复合物)，而且具有相同的荷质比，因此在SDS中，SDS-蛋白质复合物的电泳迁移率只与其分子量有关，而不再受所带电荷及分子形状的影响，且在一定条件下，迁移率与分子量呈对数线性关系;4.SDS测定分子量的操作;;5.注意事项;多亚基蛋白质分子量检测;二、凝胶过滤层析测定蛋白质的相对分子量;;3.注意事项;第三节

等电聚焦电泳测定蛋白质的等电点;等电点(isoelectricpoint,pI);+;ReadyStripTMIPGStrips;BroadRange

pH3-10;注意事项;第四节

蛋白质的免疫印迹分析;印迹技术(blotting)是指将存在于凝胶中的生物大分子转移（印迹）于或直接放在固定化介质上并加以检测分析的技术

1975年，EdwenSouthern提出了分子印迹(渍)的概念

目前这种技术已被广泛用于DNA、RNA和蛋白质的检测;印迹技术的类别及应用;一、免疫印迹分析的应用

对蛋白质进行定性分析

对蛋白质进行半定量分析

信号转导分析

生物大分子相互作用分析;

将蛋白质固定在膜上的其他应用

结构域分析

斑点印迹

抗体纯化

为制备抗体时获得相应的蛋白质抗原

蛋白质鉴定：氨基酸组成分析和序列分析;SDS基本原理

蛋白质发生不可逆的变性

多亚基蛋白质分子量检测

二硫键是否完全被还原

一、SDS测定蛋白质的相对分子量

Threelengths

用于RNA的定性定量分析

由于蛋白质常用抗体来检测，??此也被称为免疫印迹技术(immunoblotting)

用于RNA的定性定量分析

对蛋白质进行定性分析

芳香族氨基酸含量差异可以起误差

二、免疫印迹分析的基本流程

第二节蛋白质相对分子量测定

4gSDS/1g蛋白质，由于十二烷基硫酸根带负电荷，使得样品中各种蛋白质与SDS形成的SDS-蛋白质复合物都带有相同密度的负电荷，掩盖了蛋白质分子间天然的电荷差异

该法是基于考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种不同颜色的形式。

十二烷基磺酸钠(SodiumDodecylSulfonate)

第二节蛋白质相对分子量测定

分子量测定(molecularweight,MW);免疫印迹操作流程图;1.样品的制备;2.电泳分离;3.蛋白质的电转移;常用的蛋白质转移膜;电转移装置;电转移示意图;电转移装置;IsoelectricFocusing

蛋白质相对分子量测定(SDS)

许多干扰物质降低颜色反应

WatchSDS原理

快速（反应时间仅需2min）

二、免疫印迹分析的基本流程

二、考马斯亮蓝G-250检测法

蛋白质的分子量范围15～200KD之间

注意：设立阳性对照和阴性对照，阴性对照可用免疫前血清、非相关单克隆抗体；

配制标准蛋白所用溶液;;靶蛋白与第一抗体反应—单抗、多抗