植物质粒的提取以及载体构建.ppt

植物质粒的提取以及载体构建第1页，共41页，星期日，2025年，2月5日一、植物DNA的提取1、目的和意义2、原理3、试剂的准备4、操作过程5、DNA检测6、注意事项7、常见问题及解决办法第2页，共41页，星期日，2025年，2月5日1、目的和意义:1、抗性苗的检测2、分子杂交3、分子标记4、基因扩增第3页，共41页，星期日，2025年，2月5日2、原理:CTAB（十六烷基三甲基溴化铵hexadyltrimethylammomumbromide）是一种非离子去污剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA游离出来。植物材料在CTAB的处理下，结合65℃水浴使细胞裂解、蛋白质变性、DNA被释放出来。CTAB与核酸形成复合物，此复合物在高盐（0.7mM）浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（0.1-0.5mMNaCl）下CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。经离心弃上清后，最后用75%的乙醇清洗沉淀，吹干，溶于TE中。第4页，共41页，星期日，2025年，2月5日3、试剂的准备试剂的全称：CTAB：十六烷基三甲基溴化铵EDTA：已二胺四乙酸二钠PVP:聚乙烯吡咯烷酮。第5页，共41页，星期日，2025年，2月5日试剂的配制（2×CTAB（100ml））2%CTAB：2g1.4mol/LNaCl:8.19g20mmol/LEDTA:4ml(0.5mol/L母液）100mmol/LTris·Cl(PH8.0):10ml（1mol/L母液）2%PVP:2g2%?-巯基乙醇:2ml第6页，共41页，星期日，2025年，2月5日试剂的作用Tris-HCl(pH8.0)：提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏CTAB：溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离EDTA：抑制DNase活性β-巯基乙醇：抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐化，使酚类物质容易去除PVP：是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。????第7页，共41页，星期日，2025年，2月5日4、操作过程（小样法）1、将水浴锅打开，调到65度，并将裂解液放到水浴锅中预热；2、挑取1-2g幼嫩的组织放到碾钵中，加入液氮迅速研磨成粉末；3、将粉末迅速转入1.5ml的离心管中，迅速加入裂解缓冲液，混匀，放入65度水浴锅水浴30min，期间晃动离心管2-3次；4、将离心管取出冷却至室温，加入等体积的氯仿/异戊醇（24：1），混匀，静置10min；第8页，共41页，星期日，2025年，2月5日5、室温12000r离心10min，然后将上清转移至干净的新离心管中再抽提一次；6、将上清转移至干净的新离心管中，加入2/3体积的异丙醇或2倍体积的无水乙醇，混匀，静置沉淀30min，10000r离心10min；7、将上清倒掉，倒置离心管使残液流尽，加入500μ75%酒精，将沉淀摇起来放置5—10min，离心，倒掉酒精，重复一次；8、倒置离心管使残液流尽，离心，用枪头将残液吸干，吹干，溶于TE(10mMTris-HCl;1mMEDTAPH=8.0)；第9页，共41页，星期日，2025年，2月5日9、加入RNA酶，37度水浴1h或4度放置过夜；10、加入等体积的氯仿/异戊醇，混匀，静置10min，12000r离心10min；11、将上清转入新的干净离心管中，加入2倍体积的无水乙醇，混匀，静置30min，10000r离心10min；12、上清倒掉，用75%的乙醇清洗2次，倒掉酒精，离心，用枪头吸干残液，吹干，溶于TE即为可以进行分子操作的DNA。第10页，共41页，星期日，2025年，2月5日分光光度法：DNA在260nm处有最大吸收峰，蛋白质在280nm处有最大的吸收峰，盐和小分子则集中在230nm处。因此，可以用260nm波长进行分光测定DNA浓度，OD值为1相当于大约50μg/ml的dsDNA，37μg/ml的ssDNA，40μg/ml的RNA。DNA纯品的OD260/OD280为1.8，故根据OD260/OD280的值可以估计DNA的纯度。若比值较高说明含有RNA，比值较低说明有残余蛋白质存在。OD230/OD260的比值应在0.4-0.5之间，若比值较高说明有残余的盐存在。5、DNA检测第11页，共41页，星期日，2025年，2月5日Marker定量法：DNA的紫外检测通常使用荧光染料溴化乙锭，该物质含