蛋白质分子量测定方法研究进展【共21张PPT】.pptVIP

蛋白质分子量测定方法研究进展优选蛋白质分子量测定方法研究进展SDS凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳技术是实验室进行蛋白质研究中最常用的技术，兼有电泳和分子筛的双重作用。SDS是一种阴离子去污剂，可使蛋白质变性，与其蛋白质结合成带负电荷的蛋白质-SDS复合体，消除电泳过程中蛋白质所带电荷对电泳结果的影响，从而保证蛋白质电泳仅受分子质量大小的影响。在一定的电场作用下，该复合体沿着以聚丙烯酰胺凝胶形成的分子筛向电场的正极移动，从而将蛋白质根据他们的分子量大小而分开。蛋白质-SDS复合体：形状一定、电荷密度一定电喷雾是一种离子化方法，可以用作质谱仪的离子源缺点：在与高效液相色谱、毛细管电泳等分离设备的联用时，目前只能采取离线的方式，致使分析结果的重复性较差，与MALDI-MS本身高精密度的特性不匹配。对样品纯度要求高，且会形成多电荷的质谱峰群，难以分辨，使得结果分析较为困难。（K1、K2为常数，MW为分子量）粘度法是指通过测定样品溶液的粘度，从而计算样品的的分子量的方法。原理：基质辅助激光解吸电离质谱技术（MALDI-MS）是将待测物悬浮或溶解在一个基体中，基体与待测物形成混晶，当基体吸收激光的能量后，均匀传递给待测物，使待测物瞬间气化并离子化。（3）有利于对复杂混合物的分析，且能忍受较高浓度的盐、缓冲剂和其他难挥发成分，降低了对样品预处理的要求；近年来，生物质谱技术取得了突飞猛进的发展，其中以分别由科学家和科学家田中耕一发明的电喷雾离子化质谱技术（ESI-MS）及基质辅助激光解吸电离质谱技术（MALDI-MS）的贡献最为突出。电喷雾离子化质谱技术（ESI-MS）在一种理想溶液中，渗透压与溶质浓度成正比。近年来，生物质谱技术取得了突飞猛进的发展，其中以分别由科学家和科学家田中耕一发明的电喷雾离子化质谱技术（ESI-MS）及基质辅助激光解吸电离质谱技术（MALDI-MS）的贡献最为突出。（4）MALDI-TOF质谱对生物大分子分子量的测定范围是所有测试技术中最广。当蛋白质分子量在10-200kDa时，样品的迁移率和分子量的对数呈对数关系，符合如下方程式：lgMW=-b﹒Rf+K优点：操作简单，容易掌握，成本低，分辨率高，重复效果好。将它与经典的脉冲化工作方式的飞行时间质谱仪（TOF）直接联用，即我们常听到的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）。SDS凝胶电泳上样：防止样品溢出、正负极、电压SDS凝胶电泳当蛋白质分子量在10-200kDa时，样品的迁移率和分子量的对数呈对数关系，符合如下方程式：lgMW=-b﹒Rf+K其中，MW为蛋白质分子质量，Rf为相对迁移率，b为斜率，K为截距，当条件一定时，b和K为常数。因此通过已知分子量的蛋白和未知分子量蛋白的比较，就能得出未知蛋白的分子量。影响分子量测定的因素很多，包括蛋白质与SDS的结合量的不同，凝胶浓度和交联剂浓度等，如图所示。研究者测定了当交联剂浓度不变，改变凝胶浓度，下图分别对应于凝胶浓度为5%，10%，15%。SDS凝胶电泳优点：操作简单，容易掌握，成本低，分辨率高，重复效果好。缺点：对于电荷异常或者构象异常的蛋白、带有较大辅基的蛋白及一些结构蛋白测定的分子质量不太可靠，而且电泳结束后还需要染色，染色，脱色比较耗时。SDS凝胶电泳凝胶渗透层析法定义：又叫体积排阻层析、分子筛层析，当生物大分子通过装有凝胶颗粒的层析柱时，根据它们分子大小不同而进行的分离技术。固定相：惰性凝胶颗粒，颗粒内部立体网状结构，形成许多孔穴原理：通过测定高聚物稀溶液粘度随浓度的变化，即可计算出其平均分子量(粘均分子量)。优点：操作简单，设备简单，样品用量少，周期简单，条件温和，一般不引起生物活性的改变。（2）对样品分子质量测试灵敏度、分辨力和准确度都相当高；SDS凝胶电泳Ve=K1—K2logMW粘度法是指通过测定样品溶液的粘度，从而计算样品的的分子量的方法。粘度法是指通过测定样品溶液的粘度，从而计算样品的的分子量的方法。其中，MW为蛋白质分子质量，Rf为相对迁移率，b为斜率，K为截距，当条件一定时，b和K为常数。对样品纯度要求高，且会形成多电荷的质谱峰群，难以分辨，使得结果分析较为困难。SDS凝胶电泳当蛋白质分子量在10-200kDa时，样品的迁移率和分子量的对数呈对数关系，符合如下方程式：lgMW=-b﹒Rf+K多电荷使得样品谱图复杂SDS凝胶电泳电喷雾是一种离子化方法，可以用作质谱仪的离子源（1）对样品的消耗少，不会造成样品的大量浪费；凝胶渗透层析法常用凝胶：交联葡聚糖凝胶（Sephadex）、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶（Se