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食源性病原微生物检测指南

食源性病原微生物是指通过食物传播，能够引起人类疾病的微生物，包括细菌、病毒、真菌等。对食源性病原微生物进行准确、及时的检测，对于保障食品安全、预防食源性疾病的发生具有至关重要的意义。以下是一份详细的。

样品采集

1.采样原则

-代表性：所采集的样品要能代表被检测的整批食品。例如，对于大包装的食品，应从不同部位、不同层次进行采样；对于多批次的食品，要按一定比例从各批次中抽取样品。

-无菌操作：采样过程必须严格遵守无菌操作原则，防止外界微生物的污染。采样工具（如采样勺、镊子等）要经过严格的灭菌处理，采样人员要穿戴无菌工作服、手套和口罩。

2.采样方法

-固体食品：对于质地均匀的固体食品，如面包、饼干等，可直接用无菌工具采集一定量（一般为25g）的样品。对于质地不均匀的固体食品，如肉类、蔬菜等，应从不同部位选取多个采样点，然后混合成一个代表性样品。

-液体食品：对于澄清的液体食品，如牛奶、饮料等，可先将样品充分混匀，然后用无菌吸管吸取一定量（一般为25mL）的样品。对于含有悬浮物的液体食品，如酱油、醋等，应先充分振摇，使悬浮物均匀分布后再采样。

-冷冻食品：冷冻食品应在解冻后尽快进行采样。解冻方法可根据食品的性质选择合适的方式，如在4℃冰箱中缓慢解冻或在室温下自然解冻，但要注意避免二次污染。

3.样品保存与运输

-采集好的样品应立即放入无菌容器中，并做好标记。一般情况下，样品应在低温（4℃左右）下保存和运输，以抑制微生物的生长繁殖。如果需要长时间保存或运输，可将样品冷冻（-20℃以下）保存，但要注意冷冻和解冻过程可能会对某些微生物的活性产生影响。

检测前处理

1.样品均质

-将采集的样品放入无菌均质袋中，加入适量的无菌稀释液（如生理盐水），然后用均质器进行均质处理，使样品中的微生物均匀分布在稀释液中。均质时间和速度应根据样品的性质进行调整，一般为1-2分钟。

2.稀释

-根据样品中微生物的可能含量，选择合适的稀释倍数进行稀释。通常采用10倍系列稀释法，即取1mL均质后的样品加入9mL无菌稀释液中，充分混匀后得到10?1稀释液，再取1mL10?1稀释液加入9mL无菌稀释液中，得到10?2稀释液，以此类推。

3.增菌培养

-为了提高检测的灵敏度，对于一些可能含菌量较低的样品，需要进行增菌培养。将稀释后的样品接种到合适的增菌培养基中，在适宜的温度和条件下培养一定时间，使目标微生物得到大量繁殖。例如，对于沙门氏菌的检测，可将样品接种到四硫磺酸钠煌绿增菌液中，在37℃下培养18-24小时。

检测方法

1.传统培养方法

-分离培养：将增菌后的样品接种到选择性培养基上，利用选择性培养基的特性，抑制非目标微生物的生长，促进目标微生物的生长。例如，对于大肠杆菌的检测，可将样品接种到伊红美蓝琼脂培养基上，大肠杆菌在该培养基上会形成具有金属光泽的黑色菌落。然后通过划线分离等方法，将单个菌落接种到营养琼脂培养基上进行纯化培养。

-鉴定：对纯化后的菌落进行形态学观察（如菌落形态、大小、颜色等）、生理生化特性检测（如糖发酵试验、氧化酶试验等），以确定目标微生物的种类。传统培养方法是食源性病原微生物检测的经典方法，其优点是结果准确可靠，但操作繁琐、检测周期长，一般需要3-7天。

2.免疫学检测方法

-酶联免疫吸附测定（ELISA）：该方法利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过酶催化底物显色来检测目标微生物。首先将已知抗体包被在微孔板上，加入样品后，如果样品中含有目标微生物抗原，抗原会与包被抗体结合，然后加入酶标记的抗体，再加入底物，根据颜色变化判断样品中是否含有目标微生物。ELISA方法具有灵敏度高、特异性强、操作相对简单等优点，检测时间一般为几个小时。

-免疫荧光技术：免疫荧光技术是将荧光素标记在抗体上，当标记抗体与目标微生物抗原结合后，在荧光显微镜下可以观察到荧光信号，从而实现对目标微生物的检测。该方法具有快速、直观等优点，但需要专业的荧光显微镜设备。

3.分子生物学检测方法

-聚合酶链反应（PCR）：PCR技术是通过扩增目标微生物的特定核酸片段来检测微生物的存在。首先设计针对目标微生物的特异性引物，然后在PCR反应体系中加入样品DNA、引物、dNTP、Taq酶等，经过变性、退火、延伸等多个循环，使目标核酸片段得到大量扩增。最后通过凝胶电泳等方法检测扩增产物，判断样品中是否含有目标微生物。PCR方法具有灵敏度高、特异性强、检测速度快等优点，一般几个小时即可得到检测结果。

-实时荧光定量PCR：实时荧光定量PCR是在PCR反应体系中加入荧光基团，通过监测荧光信号的变化实时定量检测目