第三部分基因组和DNA测序原理.ppt

第30页，共60页，星期日，2025年，2月5日DNAtemplateisdenaturedtosinglestrands.DNAprimer(with3’endnearsequenceofinterest)isannealedtothetemplateDNAandextendedwithDNApolymerase.Fourreactionsaresetup,eachcontaining:DNAtemplatePrimerannealedtotemplateDNADNApolymerasedNTPS(dATP,dTTP,dCTP,anddGTP)Next,adifferentradio-labeleddideoxynucleotide(ddATP,ddTTP,ddCTP,orddGTP)isaddedtoeachofthefourreactiontubesat1/100ththeconcentrationofnormaldNTPs.ddNTPspossessa3’-Hinsteadof3’-OH,competeinthereactionwithnormaldNTPS,andproducenophosphodiesterbond.ManualDideoxyDNAsequencing-Howitworks:第31页，共60页，星期日，2025年，2月5日Whenevertheradio-labeledddNTPsareincorporatedinthechain,DNAsynthesisterminates.EachofthefourreactionmixturesproducesapopulationofDNAmoleculeswithDNAchainsterminatingatallpossiblepositions.Extensionproductsineachofthefourreactionmixutesalsoendwithadifferentradio-labeledddNTP(dependingonthebase).Next,eachreactionmixtureiselectrophoresedinaseparatelane(4lanes)athighvoltageonapolyacrylamidegel.Electrophoresisat70°C(2h).FixgelinHAc,drygel(1h).Autoradiography(24-48h).PatternofbandsineachofthefourlanesisvisualizedonX-rayfilm.Locationof“bands”ineachofthefourlanesindicatethesizeofthefragmentterminatingwitharespectiveradio-labeledddNTP.DNAsequenceisdeducedfromthepatternofbandsinthe4lanes.第32页，共60页，星期日，2025年，2月5日取代放射性同位素的方法地高辛,生物素:用地高辛,生物素代替发射性同位素示踪测序反应产物,最后用酶显色反应显示出测序结果.银染方法:把生成DNA分子核苷酸碱基顺序的方法与一种超敏感的银染方法相结合。这一新的技术组合使电泳分离的序列片段不依赖于仪器就直接可见。这种无放射性的系统包括通过用酶促双氧链终止反应形成一系列DNA序列片段，凝胶电泳分离这些片段，并把凝胶浸入超敏感的银染溶液中,观察引物延伸产物的银染条带,从而确定DNA分子的序列。第33页，共60页，星期日，2025年，2月5日荧光标记物ddGTPddATPddTTPddCTP第34页，共60页，星期日，2025年，2月5日引物标记法测序(DyePrimer)一个样本，4个反应。4个反应中引物序列相同，但分别标记有不同颜色的荧光。+AmpliTaqFSenzymedCTP,dATP,dGTP,dTTPddATP(terminator)+AmpliTaqFSenzymedCTP,dA