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天然水蛭素分离纯化技术的多维探索与创新突破

一、引言

1.1研究背景与意义

心血管疾病已成为危害人类健康的头号大敌，其防治一直是医学领域的研究重点。水蛭素（Hirudin）作为水蛭唾液腺分泌物中的一种蛋白，是迄今为止发现的最强的天然凝血酶特效抑制剂，具有活血、化瘀和通经作用。《神农本草经》《本草纲目》和《中国动物药》等专著中均有收载水蛭可作为防栓抗凝逐瘀之良药。现代医学研究表明，水蛭素能够与凝血酶特异性结合，抑制凝血酶的活性，从而阻止纤维蛋白原转化为纤维蛋白，达到抗凝和抗血栓形成的效果。

在临床应用中，水蛭素展现出了巨大的潜力。它可用于治疗急性心血管疾病溶栓后的治疗、预防冠脉再堵塞、动静脉血栓性疾病的治疗、散播性血管内凝血及透析中的抗凝治疗。在显微外科手术中，常因吻合处血管栓塞导致手术失败，水蛭素的应用能够促进伤口愈合，提高手术成功率。研究还发现，水蛭素在肿瘤治疗方面也有积极作用，它能够阻止肿瘤细胞的转移，对骨肿瘤、血管肉瘤、黑色素瘤和白血病等多种肿瘤有效，还可配合化学治疗和放射治疗，促进肿瘤中的血流而增强疗效。

然而，天然水蛭素的来源有限，从水蛭躯体中提取水蛭素时，存在无抗凝活性的伪水蛭素组分，且分泌物中成分复杂，这大大增加了水蛭素分离纯化的难度。而临床运用对生物制品的纯度要求极高，只有高纯度的水蛭素才能确保其在医疗应用中的安全性和有效性。因此，开展天然水蛭素的分离纯化研究具有至关重要的意义。一方面，高效的分离纯化技术能够提高水蛭素的纯度和产量，满足日益增长的临床需求，为心血管疾病、肿瘤等疾病的治疗提供更有效的药物；另一方面，深入研究水蛭素的分离纯化方法，有助于进一步探索水蛭素的结构与功能关系，推动相关药物研发和医学治疗技术的发展，具有显著的社会效益和经济效益。

1.2国内外研究现状

天然水蛭素的分离纯化研究一直是生物医药领域的热点，国内外学者围绕该课题展开了大量研究，取得了一系列成果。

在国外，早期研究主要集中在水蛭素的发现与基础性质探究。1884年，英国的Haycraft首次发现水蛭咽部具有抗凝血功能的物质，1904年，英国科学家Jacoby从水蛭唾液中成功分离出这种具有抗凝血功能的活性成分，并将之命名为“水蛭素”。1957年，Markwardt分离出了较纯的水蛭素，此后，对水蛭素的研究逐渐深入到其结构与功能层面。随着现代生物技术的发展，各种先进的分离纯化技术被应用于水蛭素的提取。如高效液相色谱（HPLC）技术凭借其高效、快速、分离效果好的特点，在水蛭素纯化中得到广泛应用。有研究利用反相高效液相色谱（RP-HPLC）对水蛭素进行分离，能够有效去除杂质，得到高纯度的水蛭素。但该方法设备昂贵，运行成本高，不利于大规模生产。亲和层析技术利用水蛭素与凝血酶之间的特异性结合作用，实现对水蛭素的高效分离，具有选择性高、纯化倍数大的优点。然而，亲和配体的制备较为复杂，成本较高，限制了其大规模应用。

国内对水蛭素的研究起步相对较晚，但发展迅速。古代医学典籍如《神农本草经》《本草纲目》等对水蛭的药用价值早有记载，但对水蛭素的现代科学研究始于上世纪末。近年来，国内学者在水蛭素分离纯化方法上不断创新。在粗提阶段，采用了多种方法。pH沉淀法通过调节粗提液的pH值，使杂质蛋白沉淀，从而初步分离水蛭素。有研究将水蛭素粗提液用0.9%的NaCl溶液稀释后，用三氯醋酸溶液调pH值至2.5，沉淀杂质蛋白，再调pH值至7.0，得到粗提液，蛋白质回收率为45.58%，活性回收率为55.55%，纯化倍数为1.22。该方法操作相对简单，但纯化倍数较低，溶液过稀，需要进一步处理。有机溶剂沉淀法利用水蛭素在不同有机溶剂中的溶解度差异进行分离。例如，使用含水15%的冷丙酮溶液沉淀水蛭素唾液腺分泌物，蛋白质回收率为18.70%，活性回收率为33.34%，纯化倍数为1.78。不过，该方法要求低温操作，过程中容易引起目标蛋白失活，且给活性测定带来困难。在精制阶段，离子交换层析法应用广泛。利用DEAESephadexA-50和DEAESepharoseCL-6B树脂对水蛭素粗提液进行离子交换层析，经过DEAESepharoseCL-6B柱层析所得到的水蛭素比活性能达到100AT-U/mg水蛭素以上，纯化倍数接近20，活性回收率较高，其分离效果优于DEAESephadexA-50柱层析。凝胶过滤层析法常与离子交换层析法联用，进一步提高水蛭素的纯度。如经DEAESepharoseCL-6B柱层析后的水蛭素溶液，再经SephadexG-25柱层析，可进一步去除杂质。

尽管国内外在天然水蛭素分离纯化方面取得了一定成果，但仍