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昆虫细胞BTI-Tn5B1-4及其克隆株无血清培养体系构建与特性解析

一、引言

1.1研究背景与意义

自1915年昆虫细胞培养起始，历经一百多年的发展，昆虫细胞培养技术取得了长足进步。从1962年Grace成功建立世界上第一个昆虫细胞系以来，目前已从100多种昆虫建立了500多株细胞系。昆虫细胞在生物学、农业以及医学等领域有着广泛应用。在农业领域，昆虫细胞可作为载体生产生物农药，用于害虫防治，如利用杆状病毒感染昆虫细胞来制备生物杀虫剂，对环境友好且针对性强。在医学领域，昆虫细胞-杆状病毒表达载体系统为生产许多具有重要生物学价值的重组蛋白提供了极具吸引力的途径，比如生产人用疫苗、重组药物蛋白等。美国食品药品监督管理局（FDA）批准的葛兰素史克（GlaxoSmithKline，GSK）人乳头瘤状病毒（HPV）疫苗Cervarix?，其主要成分是由16、18型HPV的L1蛋白组成的病毒样颗粒，便是利用昆虫杆状病毒表达系统生产的。

当前，昆虫细胞培养大多依赖含有昂贵胎牛血清（FetalBovineSerum，FBS）的培养基。血清虽对细胞生长和促进细胞分裂有重要作用，能够提供促进细胞生长、分裂和分化的激素物质，含有携带激素、矿物质、微量元素和脂类物质的转运蛋白，提供细胞贴壁因子和扩散因子，还能维持培养基的pH值并抑制蛋白酶直接或间接的酶解。但血清的使用存在诸多弊端，其来源困难，质量不稳定，不同批量之间差异大，导致实验重复性差；血清还是异源病毒污染的重要来源，增加了细胞培养的风险；并且动物血清成分复杂，众多生物大小分子混合在一起，很多成分至今不明，这对后期培养产物的分离、提纯以及检测造成极大困难，严重限制了基因工程表达产物的纯化。因此，开发无血清培养基进行昆虫细胞培养成为必然趋势。

无血清培养基具有诸多优点，其化学成分明确，培养条件易于控制，可有效除去病毒污染的来源，消除不同批次培养基之间在数量和质量上的差异，便于细胞培养产物的分离等下游操作，还能大大降低成本，为研究细胞的生理代谢、细胞信号等提供了优良平台。比如在重组蛋白表达实验中，使用无血清培养基可减少血清蛋白对目标蛋白分离纯化的干扰，提高重组蛋白的纯度和质量。

BTI-Tn5B1-4细胞（商品名HighFive）是一种常用的昆虫细胞株，由李国勋教授在康奈尔大学工作期间开发，在美国获发明专利（US5300435）并进行商品化生产，已在国际上被广泛应用于生物学基础研究，也为害虫生防和重组蛋白生产提供了新途径。对BTI-Tn5B1-4细胞及其克隆株进行无血清培养研究，不仅有助于深入了解昆虫细胞在无血清条件下的生长特性、生理代谢机制，还能为优化昆虫细胞培养工艺、提高重组蛋白表达水平提供理论依据和技术支持。通过研究其在无血清培养条件下的特性，如生长速率、病毒感染率、蛋白表达水平等，可以进一步挖掘该细胞株在生物制药、生物农药等领域的应用潜力，推动相关产业的发展。因此，开展BTI-Tn5B1-4细胞及其克隆株的无血清培养和特性研究具有重要的理论意义和实际应用价值。

1.2国内外研究现状

1.2.1昆虫细胞无血清培养研究进展

国外对昆虫细胞无血清培养的研究起步较早，在培养基配方优化、细胞适应性研究等方面取得了众多成果。早在20世纪80年代，就有研究致力于开发昆虫细胞无血清培养基，旨在摆脱对血清的依赖。如美国的一些研究团队，通过对昆虫细胞生长所需营养成分的深入研究，不断调整培养基中氨基酸、维生素、矿物质等成分的比例，成功开发出多种适用于不同昆虫细胞系的无血清培养基。

在培养基添加剂方面，国外研究发现一些生长因子和激素对昆虫细胞在无血清条件下的生长具有显著促进作用。如胰岛素样生长因子（IGF）能够促进昆虫细胞的增殖和存活，提高细胞密度。此外，脂类物质在昆虫细胞无血清培养中也备受关注，合适的脂类复合物可以改善细胞膜的结构和功能，增强细胞对无血清环境的适应能力。

在细胞培养工艺方面，国外的研究主要集中在大规模悬浮培养技术的优化。通过改进生物反应器的设计和操作参数，如搅拌速度、通气量、温度和pH值控制等，实现了昆虫细胞在无血清培养基中的高密度培养。例如，采用灌流培养技术，不断补充新鲜培养基并去除代谢废物，使昆虫细胞的密度达到了更高水平，为大规模生产重组蛋白和病毒提供了技术支持。

国内在昆虫细胞无血清培养领域的研究也取得了长足进步。科研人员在借鉴国外先进技术的基础上，结合国内实际情况，开展了一系列创新性研究。在培养基开发方面，国内多个研究团队通过自主研发，成功开发出具有自主知识产权的昆虫细胞无血清培养基，部分产品的性能已达到或接近国际先进水平。如新乡医学院王天云科研团队经过5年攻坚，成功研发出系列昆