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重组毕赤酵母表达猪α干扰素：遗传稳定性及产物分离纯化研究

一、引言

1.1研究背景与意义

在养猪业中，疾病的防治始终是保障产业健康发展的关键环节。猪α干扰素（Porcineinterferon-α，PoIFN-α）作为一种具有广泛抗病毒、抗肿瘤和免疫调节功能的细胞因子，在猪的健康维护和疾病防控中发挥着至关重要的作用。众多研究表明，PoIFN-α能够显著抑制猪流行性腹泻病毒、蓝耳病病毒和非洲猪瘟病毒等多种病毒的增殖，有效减轻病毒感染对猪体造成的损害，为猪只提供了重要的免疫保护。

传统上，猪干扰素的获取主要依赖于从猪血液中的白细胞诱导产生白细胞干扰素，但这种方法存在诸多局限性。一方面，提取得到的白细胞干扰素是多种成份的混合物，抗病毒效价较低，难以满足实际应用的需求；另一方面，生产成本高昂，且存在潜在病原污染的风险，严重限制了其大规模应用。随着生物工程技术的飞速发展，基因工程方法逐渐成为生产猪干扰素的主流手段。通过基因工程技术，可以实现猪干扰素的高效表达和大规模生产，不仅提高了产品活性，还使得质量标准更易于控制，为养猪业的疾病防治带来了新的希望。

在众多基因工程表达系统中，重组毕赤酵母表达系统脱颖而出，展现出诸多显著优势。首先，毕赤酵母含有特有的强有力的AOX（醇氧化酶基因）启动子，能够用甲醇严格地调控外源基因的表达，实现对外源蛋白表达的精准控制。其次，其表达水平高，既能在胞内表达，也可进行分泌型表达，且多数外源基因的表达水平高于细菌、酿酒酵母和动物细胞等表达系统。再者，毕赤酵母的发酵工艺成熟，易于放大，已成功实现大规模工业化高密度生产，细胞干重可达100g/L以上。此外，其培养成本低，所用发酵培养基主要由无机盐、微量元素、生物素、氮源和碳源组成，廉价而无毒，且培养基中不含蛋白，有利于下游产品的分离纯化。最后，外源蛋白基因在毕赤酵母中遗传稳定，通常整合到染色体上，随染色体复制而复制，不易丢失。

尽管重组毕赤酵母表达系统在生产猪α干扰素方面具有巨大潜力，但仍面临一些亟待解决的问题。重组毕赤酵母的遗传稳定性直接关系到生产的持续性和产品质量的一致性。在长期的培养和传代过程中，可能会出现基因丢失、突变或重组等现象，导致猪α干扰素的表达水平下降或表达产物的性质发生改变。表达产物猪α干扰素的分离与纯化也是一个关键环节。从复杂的发酵液中获得高纯度、高活性的猪α干扰素，对于提高产品的疗效和安全性至关重要，但目前的分离纯化方法仍存在成本高、效率低、操作复杂等问题。

因此，深入研究重组毕赤酵母的遗传稳定性，优化表达产物猪α干扰素的分离与纯化工艺，对于提高猪α干扰素的产量和质量具有重要的现实意义。这不仅有助于满足养猪业对高效、安全的抗病毒生物制品的迫切需求，有效预防和控制猪病毒性疾病的发生和传播，减少经济损失；还能进一步推动基因工程技术在动物生物制品领域的应用和发展，为其他生物制品的研发和生产提供有益的借鉴和参考。

1.2国内外研究现状

在重组毕赤酵母表达猪α干扰素的研究领域，国内外学者已取得了一系列重要进展。国外早在二十世纪九十年代就开始关注毕赤酵母表达系统在生产干扰素方面的潜力，并率先开展了相关基础研究。他们成功构建了重组毕赤酵母表达载体，实现了猪α干扰素基因在毕赤酵母中的初步表达，并对表达产物的抗病毒活性进行了初步检测。

国内研究起步稍晚，但发展迅速。近年来，众多科研团队积极投身于这一领域，在优化表达条件、提高表达量和活性等方面取得了显著成果。通过对发酵工艺的深入研究，包括优化培养基成分、调整发酵温度和pH值、改进诱导策略等，国内学者成功提高了猪α干扰素的表达水平和抗病毒活性。例如，江南大学的研究团队通过在线监测和分析发酵过程中一些重要的状态变量的变化趋势，发现诱导期的细胞摄氧速度（OUR）与猪α干扰素抗病毒活性密切相关，通过维持诱导期甲醇浓度于适中且较稳定（10g/L）的水平，以及适度控制混加（甘油/甲醇混合物）期间的菌体比增殖速度等操作条件，实现了毕赤酵母流加培养高效生产表达猪α干扰素，其最高抗病毒活性可达6.6×10?IU/mL，与相同发酵罐、其他控制条件下的最高活性相比提高了10倍以上，与摇瓶条件下的最高活性相比提高了300倍。

尽管取得了上述进展，但当前研究在遗传稳定性和产物分离纯化方面仍存在诸多问题与挑战。在遗传稳定性方面，虽然外源蛋白基因通常整合到毕赤酵母染色体上，但在长期的培养和传代过程中，仍可能出现基因丢失、突变或重组等现象。如在某些研究中，经过多代培养后，部分重组毕赤酵母菌株中猪α干扰素基因的拷贝数明显减少，导致表达水平下降。基因的突变也可能影响猪α干扰素的氨基酸序列，进而改变其生物学活性和功能。这些遗传稳定性问题不仅增加了生产成