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重组肠激酶包涵体的复性、纯化及新型重组子构建的探索与实践

一、引言

1.1研究背景

在生物工程领域，重组肠激酶作为一种关键的生物酶，发挥着不可或缺的作用，其应用价值广泛且影响深远。从来源上看，肠激酶分为天然肠激酶和重组肠激酶（rEK），天然肠激酶主要来源于动物的肠道组织，受到其他蛋白酶的污染，纯度低且提取分离成本较高。而重组肠激酶则是采用重组毕赤酵母高效分泌表达技术，经多级层析纯化工序得到的重组肠激酶液体或冻干粉，与天然肠激酶相比，具有更高的纯度和活性，生产过程也更加安全、可控。

重组肠激酶属于丝氨酸蛋白水解酶家族，能够特异性地识别Asp-Asp-Asp-Asp-Lys（DDDDK）序列，并水解LysC端的肽键，凭借这一特性，它能够精确地切割融合蛋白中不需要的标签部分，在蛋白质的分解、代谢等过程中扮演着至关重要的角色。在生物制药领域，重组肠激酶用于切割和纯化重组融合蛋白，可去除融合蛋白中的非目标部分，从而获得高纯度的目标蛋白，这对于生产高质量的重组蛋白药物至关重要，例如在胰岛素、生长激素等重组蛋白药物的生产过程中，重组肠激酶的精准切割确保了药物的活性和纯度，为患者提供了更有效的治疗手段。在基因工程中，它被用于切割和修饰各种基因工程产品，如重组抗体、细胞因子等，其高度的专一性保证了切割的精确性和产物的纯度，推动了基因治疗、基因编辑等前沿技术的发展。在食品工业中，肠激酶通过催化作用改善食品的口感和营养价值，比如在奶酪制作过程中，肠激酶可促进蛋白质的水解，使奶酪质地更加细腻、风味更加浓郁。在医疗诊断领域，重组肠激酶也展现出了潜在的应用价值，如用于酶联免疫吸附试验（ELISA）等诊断技术的开发，提高了疾病诊断的准确性和灵敏度。

然而，在重组肠激酶的生产过程中，包涵体的形成成为了制约其应用的一大难题。包涵体是由蛋白质在非天然状态下聚集形成的聚集体，不具备生物学活性。当重组肠激酶以包涵体的形式存在时，其后续的应用会受到严重阻碍。包涵体的形成原因较为复杂，可能是由于蛋白质在错误的环境下表达，例如温度、pH值等条件不适宜，影响了蛋白质的正常折叠；也可能是蛋白质的表达量过大，超出了细胞内蛋白质折叠机制的处理能力，导致多余的蛋白质发生聚集。包涵体的存在不仅降低了重组肠激酶的生产效率，增加了生产成本，还对其后续的复性和纯化工作提出了严峻挑战。若不能有效地解决包涵体问题，获得具有生物活性的重组肠激酶，将会限制其在各个领域的广泛应用和进一步发展。因此，深入研究重组肠激酶包涵体的复性、纯化及其新型重组子的构建具有重要的现实意义和迫切性，这也是本研究的核心出发点和关键所在。

1.2研究目的与意义

本研究旨在解决重组肠激酶生产过程中包涵体带来的一系列问题，通过对重组肠激酶包涵体的复性、纯化及其新型重组子的构建进行深入研究，以获得高活性、高纯度的重组肠激酶，并开发性能更优良的新型重组子，从而推动重组肠激酶在生物工程领域的广泛应用和进一步发展。

包涵体的形成使得重组肠激酶失去生物学活性，为了使其重新恢复活性，复性成为关键步骤。本研究将探索各种复性方法，如稀释复性、透析复性、色谱复性等，分析不同方法对重组肠激酶结构和活性的影响，优化复性条件，如温度、pH值、离子强度、变性剂浓度等，以提高复性效率，使更多的包涵体能够转化为具有活性的重组肠激酶，为后续的纯化和应用奠定基础。

在获得复性后的重组肠激酶后，纯化是提高其质量的重要环节。研究将运用离子交换色谱、凝胶过滤色谱、亲和层析等多种纯化技术，去除蛋白质中的杂质，包括未完全复性的蛋白质、氨基酸、核酸等，通过对不同纯化方法的比较和优化，确定最佳的纯化方案，提高重组肠激酶的纯度，满足生物制药、基因工程等领域对高纯度酶的严格要求。

为了进一步提升重组肠激酶的性能和稳定性，构建新型重组子是重要的研究方向。本研究将采用基因突变、基因融合等技术，在原有肠激酶基因的基础上进行改造。通过基因突变，引入特定的氨基酸突变，增强重组肠激酶的热稳定性、pH稳定性等；利用基因融合技术，将与肠激酶有高亲和力的其它蛋白质的基因片段与肠激酶基因连接起来，创造具有更强催化能力或特殊功能的重组肠激酶，以满足不同应用场景的需求。

本研究具有重要的理论意义和实际应用价值。在理论方面，深入研究重组肠激酶包涵体的复性、纯化及其新型重组子的构建，有助于揭示蛋白质折叠、聚集和修饰的机制，丰富蛋白质工程的理论知识体系，为其他蛋白质的研究提供借鉴和参考。在实际应用中，成功解决重组肠激酶包涵体问题，获得高活性、高纯度的重组肠激酶以及性能优良的新型重组子，将极大地推动生物工程领域的发展。在生物制药领域，高纯度的重组肠激酶可用于生产高质量的重组蛋白药物，提高药物的疗效和安全性，为疾病的治疗提供更有效的手段；在基因工程中，新型重组子的应用