生化技术凝胶过滤.pptVIP

1、当Kav=0时，则Ve=Vo，即对于根本不能进入凝胶内部的大分子物质全排阻，洗脱体积等于空隙体积即外水体积（图中组分Ⅰ）2、当Kav=1时，Ve=Vo+Vi。即小分子可完全渗入凝胶内部时，洗脱体积应为空隙体积与内水体积之和。Ve=Vo+Vi（图中组分Ⅲ）第27页，共67页，星期日，2025年，2月5日3、当0＜Kav＜1时，Ve=Vo+Kav（Vi＋Vg）。表示固定相中只有一部分可被组分扩散渗入，一部分被排阻，Ve即在Vo与Vo+Vi＋Vg之间变化（图中组分Ⅱ）4、有时Kav＞1，表示凝胶对组分有吸附作用（从内水中洗脱出来的含量下降），此时Ve＞Vo+Vi＋Vg。例如一些芳香族化合物如苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸等在SephadexG-25中的洗脱体积远超出理论计算的最大值第28页，共67页，星期日，2025年，2月5日二、值的测定只要测出、和，即可计算出值的测定：（1）计算法：（2）测定法：第29页，共67页，星期日，2025年，2月5日的测定：用蓝色的葡聚糖2000（M=200万），在Sephadex中被完全排阻，并借助其本身的颜色，采用肉眼或分光光度计检测（210、260或620nm）洗脱体积的测定：用、N-乙酰酪氨酸或其他小分子物质作为洗脱对象。由于分子量小，且无吸附，故洗脱体积刚好是（=1）当分子大小在凝胶孔径的上、下限之间时，则介于和之间（即=0~1）第30页，共67页，星期日，2025年，2月5日第31页，共67页，星期日，2025年，2月5日第三节操作第32页，共67页，星期日，2025年，2月5日（一）凝胶的选择1.型号：凝胶型号不一样，筛分范围亦不相同如：SephadexG型多用于分离蛋白质；生物胶和Sephacryl等多用于分离核酸；要除去蛋白质中的盐类，多用SephadexG-252.粒度：粒度与交联度无关。与粗颗粒相比，细颗粒凝胶之间空隙小，装柱易均匀，分离效果好，但流速慢；而粗颗粒凝胶流速快，宜用小颗粒直径的层析柱一、凝胶的选择与处理第33页，共67页，星期日，2025年，2月5日第34页，共67页，星期日，2025年，2月5日（二）凝胶用量计算由于凝胶在处理过程中会有一部分损失，故用此法计算出的凝胶用量需增加10~20%第35页，共67页，星期日，2025年，2月5日（三）凝胶的处理将所用的干胶置于5~10倍量的D.W中，充分浸泡（表6-2溶胀时间），用倾斜法去除表面悬浮的小颗粒，再用0.5mol/LNaOH-0.5mol/LNaCl室温浸泡0.5h，抽滤除去碱液，用D.W洗至中性。再用抽气方法以D.W或平衡液除去凝胶颗粒之间的气泡第36页，共67页，星期日，2025年，2月5日1．柱子的选择①当直径相同时，柱长长者比柱长短者分辨率高②柱长相同时，直径大者比小者分辨率高③床体积相同时，柱长长者比短的分辨率高一般理想的层析柱直径与长度之比是1：25~1：100；层析柱外面最好有夹套，能控制温度（柱温箱），以保证结果的重复性2．装柱：常用湿装法（第三章）3．凝胶柱的鉴定二、凝胶柱的制备第37页，共67页，星期日，2025年，2月5日流速、柱长对分离的影响第38页，共67页，星期日，2025年，2月5日加样量与层析柱床体积及检测方法的灵敏度有关。床体积越小、方法灵敏度越高时，加样量越少层析的目的在于分析时，加样量占床体积的1～2％，作制备、脱盐用时，占20～30％一般来说，加样量越少，分辨率越高。具体加样体积由分配系数(Kav)或洗脱体积(Ve)来决定三、加样与洗脱（一）加样第39页，共67页，星期日，2025年，2月5日第40页，共67页，星期日，2025年，2月5日VeA、VeB：组分A、B的洗脱体积KavA、KavB：组分A、B的分配系数Vs：A、B两组分的洗脱体积之差（又称为分离体积）Vs=VeA－VeB当样品体积Vp＝Vs时，理论上的洗脱图形是两种物质恰好分开(图中Ⅲ)。但由于样品流过柱时的扩散作用，其体积会逐渐增大，致使其洗脱体积远比原来大加样量（Vp）的确定第41页，共67页，星期日，2025年，2月5日图Ⅱ、Ⅲ中A、B两种物质有一定程度的交叉，这表明二者只是部分分开。因此，当Vp等于或大于Vs时