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烟草高抗花叶病品种的分子标记筛选及应用

1.引言

1.1研究背景

烟草花叶病（TobaccoMosaicVirus，TMV）是烟草生产中常见且分布广泛的病毒性病害，对烟草的产量和质量具有严重的影响。自1898年烟草花叶病被发现以来，它一直是烟草生产的主要威胁之一。该病毒通过汁液传播，能够在多种植物之间传播，且变异速度快，防治难度大。传统的防治方法主要包括化学防治和农业防治，但这些方法要么成本高昂，要么对环境造成不利影响。

随着分子生物学和生物信息学的发展，分子标记辅助育种成为提高植物抗病性的有效途径。分子标记技术能够在DNA水平上准确地区分不同个体之间的遗传差异，为植物育种提供了一种高效、准确的手段。近年来，研究者已经在多种作物中成功地利用分子标记技术筛选出抗病品种，但关于烟草高抗花叶病品种的分子标记研究尚不充分。

1.2研究目的和意义

本研究旨在利用基因组学和生物信息学方法，对烟草基因组进行深入分析，筛选出与烟草高抗花叶病相关的分子标记。研究的主要目的包括：

对烟草基因组进行测序，获取全面的基因组信息。

利用生物信息学手段分析基因组数据，鉴定与抗病性相关的基因和分子标记。

通过实验验证筛选出的分子标记在烟草抗病育种中的应用价值。

本研究的意义在于：

为烟草抗病育种提供新的分子标记，加快抗病品种的选育进程。

提高烟草对花叶病的抗性，减少化学农药的使用，降低生产成本，保护生态环境。

为其他作物的抗病育种提供参考，推动分子标记技术在农业生产中的应用。

通过本研究的实施，不仅可以为烟草产业的可持续发展提供技术支持，而且对于推动我国农业现代化进程具有重要的理论与实践意义。

2.材料与方法

2.1实验材料

本研究所用烟草材料包括高抗花叶病品种和感病品种，均由我国某烟草研究单位提供。实验材料种植于实验基地，生长条件保持一致。在烟草生长至适宜时期，采集叶片用于后续实验。

2.2实验方法

2.2.1基因组DNA提取

采用CTAB法提取烟草叶片基因组DNA。具体步骤如下：取新鲜烟草叶片约0.5g，加入液氮充分研磨至粉末状，转入1.5mL离心管中；加入500μLCTAB提取缓冲液（2%CTAB，100mmol/LTris-HClpH8.0，1.4mmol/LNaCl，20mmol/LEDTA，0.1%β-巯基乙醇），65℃水浴30min；加入等体积的氯仿-异戊醇（24:1）溶液，剧烈振荡混匀，12000r/min离心10min；取上清，加入0.6体积的异丙醇，轻轻混匀，室温沉淀10min；12000r/min离心10min，弃上清，加入70%乙醇洗涤沉淀，晾干后溶于适量TE缓冲液。

2.2.2基因组测序

利用IlluminaHiSeq测序平台对提取的基因组DNA进行测序。首先对基因组DNA进行打断、建库，然后进行测序。测序得到的原始数据经过质量控制、过滤后，用于后续分析。

2.2.3分子标记开发

根据测序结果，利用生物信息学方法筛选出与烟草花叶病抗性相关的基因。通过对这些基因进行序列分析，开发出相应的分子标记。本研究主要采用以下几种分子标记：SimpleSequenceRepeat（SSR）、SingleNucleotidePolymorphism（SNP）和Insertion/Deletion（InDel）。

2.2.4抗病育种验证

将筛选出的分子标记应用于抗病育种。具体步骤如下：首先，利用分子标记对亲本进行基因型分析，筛选出具有抗性的亲本；然后，进行杂交、自交等遗传操作，获得抗性后代；最后，通过温室和大田试验，验证后代的抗病性。

2.3数据分析

2.3.1基因组数据分析

利用生物信息学软件对测序得到的基因组数据进行组装、注释和比较分析。具体步骤如下：首先，使用Trinity软件对测序数据进行组装，得到转录本序列；然后，利用blast方法对转录本序列进行注释，得到基因功能信息；最后，通过比较分析，筛选出与烟草花叶病抗性相关的基因。

2.3.2分子标记数据分析

利用生物统计方法对分子标记数据进行处理和分析。具体步骤如下：首先，利用PopGene软件计算各分子标记的遗传多样性指数，包括多态性信息含量（PIC）、基因多样性指数（GD）和香农多样性指数（I）；然后，利用NTSYS软件进行聚类分析，构建亲本的遗传关系树；最后，结合田间试验结果，分析分子标记与抗病性的关联性。

2.3.3抗病性评价

采用温室和大田试验，对烟草材料的抗病性进行评价。温室试验采用接种病原菌的方法，观察烟草植株的发病情况；大田试验则根据烟草植株在自然条件下的发病情况，评价其抗病性。结合分子标记数据和抗病性评价结果，筛选出具有较高抗病性的烟草品种。

3.烟草基因组测序与分析

3.1基因组测序