第一章蛋白质的分离与纯化课件.pptVIP

（3）在分配层析柱中，溶质在两相中达到分配平衡的速度很快，并且A物质的存在不影响B物质的分配性质，反之亦然（4）在该溶剂系统中，A和B两物质的分配系数分别设为：KA=CASCAM=1KB=CBSCBM=1/3第30页，共73页，星期日，2025年，2月5日如果在层析开始时，在第一层的S相中同时加入A和B两种物质，加入的量均为1。根据分配定律，M加入后，在两相中立刻进行分配，并且很快达到分配平衡。第一次分配前后A和B物质在S和M相中的量为：第31页，共73页，星期日，2025年，2月5日第32页，共73页，星期日，2025年，2月5日第33页，共73页，星期日，2025年，2月5日A和B物质在层析柱中1.分配10次；2.分配20次；3.分配30次第34页，共73页，星期日，2025年，2月5日二者之间总是存在着一定的偏差，这是因为：层析柱中总是或多或少地存在着纵向扩散层析过程不可能在绝对分配平衡的情况下进行理论曲线和实际洗脱曲线是否相符？因此，通常实际的洗脱曲线都比理论曲线低而宽第35页，共73页，星期日，2025年，2月5日Martin和Synge计算了硅胶柱的理论塔板数，求得一个理论塔板的高度为0.002厘米Verzele计算为0.02厘米1厘米的层析柱最少有50个理论塔板，那么，在一根20厘米的层析柱上最少可以进行1000次分配。一根分配层析柱上到底能进行多少次分配？第36页，共73页，星期日，2025年，2月5日塔板理论的要点：分配层析柱象分馏柱一样可以分成很多层，每层为一理论塔板，其高度为理论塔板高度。在一定的条件下，一根分配层析柱的理论塔板数是一定的在分配层析柱中，物质只有横向扩散，没有纵向扩散，而且在两相间达到分配平衡的速度很快体系中其他物质的存在不影响待分离物质的分配。待分离物质的存在也不影响其他物质的分配在分配层析柱上，物质在各个理论塔板中的含量可通过计算求得三、塔板理论第37页，共73页，星期日，2025年，2月5日第三节蛋白质的层析分离层析柱泵系统（缓冲液）检测器（记录仪）部分收集器液相层析的基本装置第38页，共73页，星期日，2025年，2月5日一、离子交换层析(ionexchangechromatography)原理：利用生物大分子与具有相反电荷的离子交换剂之间相互作用不同而进行的分离类型：阴离子交换剂(anion-exchangechromatography)阳离子交换剂(cation-exchangechromatography)第39页，共73页，星期日，2025年，2月5日第40页，共73页，星期日，2025年，2月5日第41页，共73页，星期日，2025年，2月5日样品的准备剂型的选择离子交换剂的预处理装柱(样品体积的2-5倍）柱效应的标定上样洗脱操作要点：分步洗脱法(stepwiseelution)梯度洗脱法(gradientelution)目的蛋白的鉴定与回收离子交换剂的再生与储存离子交换层析第42页，共73页，星期日，2025年，2月5日原理：利用分子筛效应分离提纯具有生物活性的生物大分子物质二、凝胶过滤层析(gelfiltrationchromatography)凝胶的种类：琼脂糖凝胶(Sepharose)交联葡聚糖凝胶(Sephadex)聚丙烯酰胺基葡聚糖凝胶(Sephacryl)第43页，共73页，星期日，2025年，2月5日第44页，共73页，星期日，2025年，2月5日样品的准备凝胶的选择与处理装柱（L:W=50-100:1）柱填充的检测上样（1%-5%)洗脱目的蛋白的鉴定与回收层析柱再生与储存操作要点：凝胶过滤层析的应用：脱盐蛋白质分离相对分子质量测定凝胶过滤第45页，共73页，星期日，2025年，2月5日用途蛋白质纯化蛋白质纯化后脱盐蛋白质分子量测定研究蛋白质寡聚体第46页，共73页，星期日，2025年，2月5日原理：利用生物大分子与其特异性配基的专一性识别和可逆性结合而建立起来的分离方法三、亲和层析(affinitychromatography)改变大分子物质与配体之间的亲和力改变pH梯度?洗脱：第47页，共73页，星期日，2025年，