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基于RNA干扰技术：沉默乙酰肝素酶对胃癌细胞侵袭转移影响的体外研究

一、引言

1.1研究背景与意义

胃癌是一种严重威胁人类健康的消化道恶性肿瘤，其发病率和死亡率在全球范围内均位居前列。据统计，每年全球约有大量新发病例，且多数患者在确诊时已处于中晚期。胃癌不仅会导致患者出现上腹疼痛、不适、食欲下降、恶心、呕吐、吞咽困难等症状，严重影响其正常生活，还会因癌细胞的侵袭和转移，造成机体多脏器功能下降，体质下降，最终导致全身恶液质，机能消耗，衰竭而亡。我国作为胃癌高发国家，面临着严峻的防治挑战。

肿瘤的侵袭和转移是导致胃癌患者预后不良的主要原因，其过程涉及多个复杂步骤，其中穿越由细胞外基质（ECM）和基膜（BM）组成的屏障是关键环节。乙酰肝素酶（Heparanase，HPA）作为目前发现的哺乳动物细胞中唯一能切割细胞外基质中硫酸肝素蛋白多糖侧链的内源性糖苷酶，在肿瘤侵袭和转移中发挥着重要作用。它通过降解硫酸乙酰肝素，破坏细胞外基质及基底膜的完整性，使基质中储存的大量生长因子如碱性成纤维因子和血管内皮生长因子（VEGF）释放，不仅促进血管生成，还能降解正常组织屏障中的主要成分，有利于肿瘤细胞游出，单独或协同VEGF促进肿瘤微血管的生成，进而促进肿瘤的侵袭及转移。研究表明，在多种人类恶性肿瘤中，尤其是侵袭转移性强的肿瘤，HPA基因均有较高水平的表达，在胃癌组织中的表达水平也显著高于正常组织，且与肿瘤的分化程度、淋巴结转移和TNM分期密切相关，提示HPA在胃癌的发展进程中扮演着关键角色。

基于HPA在肿瘤侵袭和转移中的关键作用，以其为靶点进行肿瘤治疗成为新的研究方向。通过沉默乙酰肝素酶，有望阻断其促进肿瘤侵袭转移的信号通路，为胃癌的治疗开辟新途径。深入研究沉默乙酰肝素酶对胃癌侵袭转移的影响，不仅有助于揭示胃癌侵袭转移的分子机制，为胃癌的早期诊断和预后评估提供潜在的生物标志物，还能为开发新的治疗策略和药物靶点提供理论依据，具有重要的临床应用价值，对改善胃癌患者的生存质量和预后具有深远意义。

1.2国内外研究现状

在国际上，对乙酰肝素酶（HPA）与肿瘤关系的研究起步较早。自1999年HPA基因被成功克隆后，众多研究聚焦于其在肿瘤侵袭转移中的作用机制。有国外学者通过基因转染实验，将HPAcDNA导入无转移潜力的小鼠淋巴瘤拟胚体细胞系和低转移潜力的黑色素瘤细胞系，结果发现转染细胞获得了高转移潜能，经裸鼠静脉接种后，转染组出现明显肝转移灶，证实了HPA在肿瘤转移中的关键作用。在胃癌研究领域，大量临床样本分析表明，HPA在胃癌组织中的表达水平显著高于正常胃黏膜组织，且与肿瘤的分化程度、淋巴结转移及TNM分期密切相关。例如，有研究对多例胃癌患者的癌组织和癌旁正常组织进行检测，发现HPA在胃癌组织中的阳性表达率较高，且在低分化、有淋巴结转移及晚期胃癌患者中的表达更为显著。

在国内，相关研究也取得了丰富成果。许多科研团队利用RNA干扰技术沉默HPA基因，观察其对胃癌细胞生物学行为的影响。王栓柱等人设计了4个针对人HPA基因的小干扰RNA靶位点，并构建质粒表达载体转染人胃癌细胞株SGC-7901，通过RT-PCR和Westernblot检测发现，转染后细胞的HPAmRNA和蛋白表达量明显下降，且Transwell小室侵袭试验和划痕损伤实验表明，细胞的侵袭和迁移能力显著减弱，这表明沉默HPA可有效抑制胃癌细胞的侵袭转移。此外，国内学者还对HPA在胃癌组织中的表达与临床病理特征的关系进行了深入研究，进一步证实了HPA高表达与胃癌的不良预后相关。

然而，当前关于沉默乙酰肝素酶对胃癌侵袭转移影响的研究仍存在一些不足。一方面，在分子机制研究方面，虽然已知HPA通过降解硫酸乙酰肝素促进肿瘤侵袭转移，但HPA调控的下游信号通路以及与其他相关分子的相互作用尚未完全明确，需要进一步深入探索。另一方面，现有的研究多集中在细胞实验和动物模型，在临床应用方面的研究相对较少，如何将沉默HPA的研究成果转化为有效的临床治疗手段，仍面临诸多挑战。此外，不同研究中采用的实验方法和模型存在差异，导致研究结果之间的可比性受到一定影响，这也为该领域的深入研究带来了一定困难。

1.3研究目的与创新点

本研究旨在通过RNA干扰技术沉默乙酰肝素酶（HPA）基因，深入探讨其对胃癌细胞侵袭转移能力的影响，具体目的如下：首先，构建针对HPA基因的小干扰RNA（siRNA）表达载体，并转染至人胃癌细胞株，实现对HPA基因表达的有效沉默。其次，运用实时荧光定量PCR（RT-PCR）和蛋白质免疫印迹（Westernblot）技术，检测转染前后胃癌细胞中HP