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鹦鹉热衣原体超快速荧光PCR检测技术规范
1范围
本文件描述了鹦鹉热衣原体超快速荧光PCR检测方法。
本文件适用于哺乳动物、禽类和环境样品中鹦鹉热衣原体的检测。
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过本文件的规范性引用而成为本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB19489实验室生物安全通用要求
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1超快速荧光PCRultra-fastReal-timePCR
一种基于快速温控模块技术（升降温速率40℃/s以上），结合快速启动酶及高特异性预混反应体系所构建的高效核酸扩增检测方法，可在8~15min内完成45个循环检测。
4缩略语
下列缩略语适合本文件。
PCR：聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction）
Ct值：阈值循环数（Cyclethreshold）
DNA：脱氧核糖核酸（DeoxyribonucleicAcid）
F：上游引物（Forwardprimer）
R：下游引物（Reverseprimer）
P：探针（Probe）
BHQ2：黑洞淬灭剂2（BlackHoleQuencher1）
FAM：6-羧基荧光素（6-Carboxyfluorescein）
MGB：MinorGrooveBinderQuencher淬灭基团
Cy5：近红外荧光染料（Near-infraredfluorescentdyes）
PBS：磷酸盐缓冲液（Phosphatebuffersolution）
Cps：鹦鹉热衣原体（Chlamydiapsittaci）
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5试剂和耗材
5.1试剂
5.1.1除另有说明，所用试剂均为分析纯。
5.1.2PBS（pH=7.2）配制方法见附录A中A.1。
5.1.3阴性对照为灭菌生理盐水，配制方法按照附录A中A.2。
5.1.4阳性对照为鹦鹉热衣原体OmpA基因序列重组质粒，制备方法见附录B中B.2。
5.1.5内参为哺乳动物β-actin基因重组质粒，制备方法按照附录B中B.4。
5.1.6超快速荧光PCR预混液（包含5×PCRbuffer、Mg2+、dNTP）。
5.1.7快速启动聚合酶（5U/μL）。
5.1.8DNA提取试剂盒。
5.1.9超快速荧光PCR板。
5.2引物和探针
超快速荧光PCR扩增（鹦鹉热衣原体和内参基因序列）上、下游引物和探针序列参见附录C.1。
6仪器设备
6.1超快速荧光PCR仪。
6.2移液器（量程：0.5μL～10μL、10μL～100μL、100μL～1000μL）。
6.3生物样品均质器。
6.4冷冻高速离心机。
6.5Ⅱ级生物安全柜。
6.6高压灭菌器。
6.7pH计。
7样品采集与处理
采样及样品前处理过程须戴一次性手套，样品不得交叉污染。实验室生物安全符合GB19489规定。
7.1采样工具
剪刀、镊子、棉拭子、Eppendorf管、研磨管等采样工具需经121℃(±2℃)高压灭菌15min方可使用。
7.2采样方法
7.2.1泄殖腔、喉拭子
将棉拭子伸入喉头来回刮2次～3次，取咽喉分泌液；将棉拭子伸入泄殖腔旋转一圈并沾取少量粪便；随后将棉拭子放入装有1.0mLPBS的Eppendorf管中。充分混匀后，12000r/min离心1min，取上清转入新的Eppendorf管中编号备用。
7.2.2环境拭子
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将拭子在物体表面来回刮2次～3次，每支拭子分别放入装有1mLPBS溶液的Eppendorf管，充分震荡混匀，12000r/min离心1min，取上清转入新的Eppendorf管中编号备用。
7.2.3组织样品
无菌操作取肾脏、肝脏、脾脏、心脏等器官组织样品放入2mL研磨管中，加入1mLPBS溶液，放入生物样品均质器7000r/min匀浆3次，每次20s，每次间隔20s进行匀浆，瞬时离心后获组织匀浆液，取上清转入新的Eppendorf管中编号备用。
7.3样品运输
样品运输应符合NY/T541的规定。
8操作方法
8.1样品核酸提取
样品前处理后，加入5μL内参参与核酸提取，DNA提取过程详见附录D，也可采用其他等
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