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狂犬病毒CVS株核蛋白于大肠杆菌的高效表达与精准鉴定研究

一、引言

1.1研究背景

狂犬病是一种由狂犬病病毒（Rabiesvirus,RV）引起的人兽共患的急性、进行性、致死性中枢神经系统传染病，一旦发病，病死率几乎达100%。据世界卫生组织（WHO）统计，全球每年约有5.9万人死于狂犬病，亚洲和非洲是狂犬病的高发地区，其中印度的狂犬病死亡人数最多，我国每年也有数百人死于狂犬病。狂犬病不仅对人类健康构成严重威胁，也给畜牧业带来巨大经济损失，如2018年我国因狂犬病导致的畜牧业经济损失高达数亿元。

RV属于弹状病毒科（Rhabdoviridae）狂犬病病毒属（Lyssavirus），其基因组为单股负链RNA，长度约为12kb，编码5种结构蛋白，分别为核蛋白（Nucleoprotein,N）、磷蛋白（Phosphoprotein,P）、基质蛋白（Matrixprotein,M）、糖蛋白（Glycoprotein,G）和RNA聚合酶（Largeprotein,L）。在这5种蛋白中，核蛋白在病毒的生命周期中发挥着关键作用。

核蛋白是病毒粒子中含量最丰富的蛋白，每个病毒粒子大约含有1000个拷贝的核蛋白。它与病毒RNA紧密结合，形成核糖核蛋白复合物（RNP），该复合物是病毒基因组的存在形式，不仅保护病毒RNA免受核酸酶的降解，还维持了RNA所处核衣壳的螺旋对称结构，为病毒的转录和复制提供了必要条件。研究表明，在病毒入侵宿主细胞的过程中，RNP复合物能够高效地将病毒基因组传递到宿主细胞的细胞质中，启动病毒的感染过程。

此外，核蛋白还参与了病毒的转录调控。它可以与病毒的转录酶相互作用，调节病毒基因的转录起始、延伸和终止，对病毒的增殖和感染能力具有重要影响。在病毒感染宿主细胞后，核蛋白能够迅速结合到病毒基因组的启动子区域，招募转录酶，启动病毒基因的转录，从而促进病毒的大量增殖。

核蛋白具有良好的免疫原性，是狂犬病诊断和疫苗免疫效果评价的重要靶标。机体感染RV后，免疫系统会针对核蛋白产生特异性抗体和细胞免疫应答。临床上，常通过检测血清中抗核蛋白抗体的水平来辅助诊断狂犬病。同时，在狂犬病疫苗的研发和质量控制中，核蛋白也被广泛应用于疫苗免疫效果的评价，如通过检测接种疫苗后动物体内抗核蛋白抗体的产生情况，来评估疫苗的免疫原性和保护效果。

狂犬病病毒CVS株（Challengevirusstandardstrain）是一种常用的狂犬病病毒标准毒株，在狂犬病的研究中具有重要地位。对CVS株核蛋白的深入研究，有助于进一步揭示狂犬病病毒的致病机制，为狂犬病的诊断、预防和治疗提供理论依据和技术支持。例如，通过解析CVS株核蛋白的结构和功能，可以开发更加灵敏、特异的诊断方法，提高狂犬病的早期诊断率；基于核蛋白的免疫原性，研发新型的狂犬病疫苗，增强疫苗的免疫效果，降低狂犬病的发病率。

综上所述，狂犬病病毒CVS株核蛋白在病毒的生命周期中扮演着至关重要的角色，对其进行深入研究具有重要的理论意义和实际应用价值。

1.2大肠杆菌表达系统概述

1.2.1大肠杆菌表达系统原理

大肠杆菌表达系统是目前应用最为广泛的重组蛋白表达系统之一，其原理基于分子生物学中的基因表达调控机制。在该系统中，首先需要构建一个含有外源基因的表达载体。表达载体通常是一种质粒，它包含了多个关键元件，如复制起点、启动子、多克隆位点、终止子以及筛选标记等。其中，启动子是一段能够被RNA聚合酶识别并结合的DNA序列，它决定了基因转录的起始位置和效率。常见的启动子有T7启动子、lac启动子、trp启动子等，不同的启动子具有不同的调控特性和表达强度。多克隆位点则是一段含有多个限制性内切酶识别位点的DNA序列，便于外源基因的插入。终止子用于终止转录过程，确保转录产物的完整性。筛选标记如抗生素抗性基因，可用于筛选含有重组质粒的大肠杆菌细胞。

将构建好的表达载体通过转化的方法导入大肠杆菌宿主细胞中。转化是指将外源DNA分子引入受体细胞，使其获得新的遗传特性的过程。常用的转化方法有化学转化法和电转化法。化学转化法是利用化学试剂（如氯化钙）处理大肠杆菌细胞，使其细胞膜通透性增加，从而使外源DNA能够进入细胞内。电转化法则是通过高压电脉冲作用，在细胞膜上形成小孔，促使外源DNA进入细胞。

进入大肠杆菌细胞的表达载体，会利用细胞内的各种酶和蛋白质合成机器，启动外源基因的转录和翻译过程。在转录阶段，RNA聚合酶识别并结合到启动子上，沿着DNA模板链合成信使RNA（mRNA）。mRNA合成完成后，便进入翻译阶段。在核糖体的作用下，mRNA上的遗传密码被翻译成氨基酸序列，进而合成目标蛋白。