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双生病毒DNA1分子诱导基因沉默体系：构建、优化与多元应用

一、引言

1.1研究背景与意义

基因沉默作为生命科学领域的核心机制之一，在生物体内基因表达调控中发挥着关键作用。它指的是生物体中特定基因由于多种因素导致表达受抑或表达量降低的现象，涵盖转录水平基因沉默（TGS）与转录后水平基因沉默（PTGS）。转录水平基因沉默主要受DNA甲基化、异染色质化及位置效应等影响，使得DNA无法正常转录为RNA；转录后水平基因沉默则是在RNA水平上对基因表达进行调控，表现为外源基因虽能转录成mRNA，但mRNA无法正常积累，会迅速被降解或被反义RNA、蛋白质封闭。基因沉默现象广泛存在于植物、线虫、真菌、昆虫、原生动物、果蝇、斑马鱼及老鼠等众多生物中，是生物体在基因调控层面的一种自我保护机制，既能限制外来核酸的入侵，又与生物的生长发育密切相关。

在植物基因功能研究领域，准确解析基因功能对理解植物生长发育、应对环境胁迫及病虫害防御等过程至关重要。传统的基因功能研究方法，如基因敲除技术，虽能有效沉默基因，但存在投入大、周期长、操作复杂等局限。而病毒诱导的基因沉默（VIGS）技术凭借独特优势，为植物基因功能研究开辟了新路径。VIGS技术利用携带植物功能基因cDNA的病毒载体侵染植物，诱导植物功能基因沉默，研究者可通过观察植物表型或生理指标变化来推断基因功能。这一技术无需获取全基因组序列信息，只需知晓目标基因序列，且能通过感染方式对不同植物品种和组织部位进行基因沉默操作，适用范围广泛。

双生病毒作为一类在全球广泛分布的植物单链DNA病毒，具有孪生颗粒形态，依据基因组结构、昆虫介体和寄主范围可分为玉米线条病毒属、菜豆金黄花叶病毒属、曲顶病毒属和伪曲顶病毒属。其中，菜豆金黄花叶病毒属病毒经济重要性突出，自然条件下主要侵染双子叶植物，由烟粉虱传播。部分双生病毒含有DNA1分子，在病毒致病及与寄主互作过程中扮演关键角色。近年来，基于双生病毒DNA1分子构建基因沉默载体成为研究热点，利用其诱导的基因沉默体系在植物基因功能研究中展现出巨大潜力。

本研究聚焦双生病毒DNA1分子诱导的基因沉默体系，致力于构建高效稳定的基因沉默体系，并深入探究其在植物基因功能研究和病虫害防治等方面的应用。在植物基因功能研究方面，该体系有望助力解析植物生长发育相关基因功能，为培育优良品种提供理论支撑；揭示植物抗病、抗逆相关基因作用机制，增强植物对病虫害和环境胁迫的抵抗力。在病虫害防治领域，可基于该体系开发新型生物防治策略，通过沉默害虫或病原菌关键基因，抑制其生长繁殖，减少化学农药使用，降低环境污染，保障农业可持续发展。

1.2双生病毒概述

双生病毒（Geminiviruses）是一类在全球范围内广泛分布且危害严重的植物单链DNA病毒，因其独特的孪生颗粒形态而得名。这类病毒在植物病毒中占据重要地位，其基因组结构、传播方式及寄主范围等方面的特性，使其成为植物病理学和病毒学研究的重点对象。

根据基因组结构、昆虫介体和寄主范围的差异，双生病毒科（Geminiviridae）被划分为四个属，分别是玉米线条病毒属（Mastrevirus）、菜豆金黄花叶病毒属（Begomovirus）、曲顶病毒属（Curtovirus）和伪曲顶病毒属（Topocuvirus）。在这四个属中，菜豆金黄花叶病毒属病毒经济重要性尤为突出，包含100多个独立种。在自然条件下，该属病毒主要侵染双子叶植物，并且全部由烟粉虱（Bemisiatabaci）传播，因此也被称作粉虱传双生病毒（whitefly-transmittedgeminiviruses,WTG）。

双生病毒的结构具有显著特点，其病毒粒子为双联体结构，由两个不完整的二十面体组成。这种独特的结构使其在电子显微镜下呈现出独特的形态，易于识别。从基因组构成来看，大多菜豆金黄花叶病毒属的双生病毒包含两个大小相近的单链环状DNA（ssDNA）组份，分别为DNA-A和DNA-B，大小通常在2.5-3.0kb。其中，DNA-A编码与病毒复制、转录激活、外壳蛋白合成等相关的基因，在病毒的生命周期中起着核心作用；DNA-B则编码参与病毒细胞间运动的蛋白，对于病毒在植物体内的扩散至关重要。然而，部分双生病毒为单组份病毒，仅含有DNA-A组份，为了完成侵染过程，它们通常需要依赖一些小分子DNA，如DNAβ和DNA1等卫星分子。

双生病毒的传播方式主要依赖昆虫介体，其中烟粉虱是传播菜豆金黄花叶病毒属病毒的关键媒介。烟粉虱在吸食感染双生病毒的植物汁液时，病毒粒子会进入其体内，并在肠道、唾液腺等组织中进行复制和传播。当烟粉虱再次取食健康植物时，病毒便会随之注入，从而实现病毒的传播扩散。除了烟粉