基于主成分分析的多重定量PCR荧光串扰校正.pdfVIP

第44卷，第4期光谱学与光谱分析Vol44,No.4,pp1151-1157

2024年4月SpectroscopyandSpectralAnalysisApril,2024

基于主成分分析的多重定量PCR荧光串扰校正

王鹏1.2,3，王振亚²，汪舜²，张杰²，张哲²，杨天航²，王弼陡1.2*，

罗刚银1.2*，翁良飞²，张宇，李原3

1.中国科学技术大学生物医学工程学院（苏州），生命科学与医学部，江苏苏州215163

2.中国科学院苏州生物医学工程技术研究所工程化研究中心，江苏苏州215163

3.重庆国科医创科技发展有限公司分子诊断中心，重庆400700

摘要聚合酶链式反应(PCR)是分子生物学常用的检测手段，主要用于对生物的DNA或RNA进行检测。

由于荧光光谱重叠和滤光片过滤带宽限制，检测时所获得的荧光数据通常会包含荧光通道之间的串扰，串

扰的存在使PCR结果分析变得复杂，并可能影响最终的检测结果。选择合适的光学元件，并确定通道间的

补偿矩阵，可以降低甚至消除荧光串扰。目前荧光补偿矩阵大多通过迭代计算获得，还没有一种简单的方法

可以从混合的多通道荧光数据中找到荧光补偿矩阵。为了快速获得荧光补偿矩阵，减小计算量，采用主成分

分析法（PCA)中确定主成分的方式，基于搭建的测试平台进行单一染料实验，获得染料的荧光信号在各个

检测通道的分布情况，计算得到荧光补偿矩阵。通过分析补偿矩阵，发现对于搭建的硬件系统，Cy5染料对

Cy5.5通道串扰较大，串扰比例为8.76%，同时Cy5.5染料对Cy5通道串扰影响也相对较大，比例约为

6.2%；其次是ROX染料对HEX通道串扰，比例约为2.68%；HEX染料对FAM通道串扰，比例约为

1.58%；FAM染料对HEX通道串扰相对较小，比例约为0.25%，其余通道无明显串扰，与荧光光谱反映的

结果一致。采用得到的荧光补偿矩阵对单一染料实验得到的原始荧光数据进行处理，有效去除了非目标通

道的荧光串扰，实现了荧光通道数据的解耦，验证了方法的可行性。最后设计了染料颜色分辨实验，将不同

浓度的多种染料进行组合测试，并采用所提出的方法将得到的数据进行荧光补偿。实验结果表明，荧光通道

各自的线性相关性较高，五个荧光通道的线性相关系数r均大于0.99，该结果进一步验证了该补偿方法的

有效性。

关键词聚合酶链式反应（PCR)检测；光谱分析；主成分分析；多重荧光检测；荧光串扰；荧光分离

中图分类号：TH79文献标识码：AD0I:10.3964/j.issn,1000-0593(2024)04-1151-07

反映被测目标的准确值。研究中主要采取以下几种解决方式

引言来减少串扰带来的影响，（一）通过系统设计，如滤光片选择

或分时复用等方式，最大限度地减少干扰的存在。如Lewis

聚合酶链式反应（polymerasechainreaction，PCR）是分等采用分时复用的方式将各波段的激光脉冲及对应染料的荧

子生物学常用的检测手段，能够检测生物特定DNA和RNA光信号在时间上分离，消除了传统DNA测序技术的光谱串

的浓度，对疾病诊断、法医鉴定和食品安全检测等应用有重扰[6]。该方法降低了对染料的要求，但对所用荧光染料仍有

要的意义[1-5]。其主要原理是在PCR过程中，加人能够与待所限制。（二）根据系统采用的硬件参数，正向计算获得荧光

测核酸反应的特定荧光基团，通过检测荧光值的上升，推算补偿系数。如GeiBler等设计的FRET生物传感器，其补偿

核酸量的增加过程。理论上，检测到的荧光值大小，能够对矩阵中各元素通过荧光光谱直接计算获得[7]。Liu等同样是

应已反应荧光染料的浓度，可以推算出核酸的量。