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三、凝胶色谱分离特点:(1)凝胶不与溶质分子发生作用,分离条件温和,蛋白质收率高,重现性好;(2)应用范围广,分离分子量的覆盖面大,可分离从几百到数百万分子量的分子;(3)设备简单,易于操作,周期短,层析剂不需再生即可反复使用,有的可连续使用几百次至上千次。凝胶色谱分离原理示意图凝胶色谱分离原理示意图含有大小不同分子的混合液加入色谱柱顶端,小分子溶质进入凝胶颗粒的微孔中,在凝胶内部扩散;而大分子溶质不能进入凝胶内部,只能随着流动相顺着凝胶间隙流下来,其下移通道较短,下移速率较快,将首先被洗脱出来;小分子下移通道较长,下移速率较慢,在色谱柱中逐渐与大分子物质拉开距离。随着洗脱过程的进行,小分子物质慢慢从凝胶柱中流出。第五节柱色谱分离法一、层析剂:用于色谱分离技术中的固定相或分离介质,总称为层析剂。它由基质和表面活性官能团组成。其中,层析剂的基质材料应为化学惰性物质,与目的产物和杂质都无结合作用;活性官能团则根据所用色谱分离方法选用或者制取。生物产品所需固定相或层析剂具有的特性(1)不溶于流动相,且具有较好的化学稳定性和机械强度;(2)具有较大的表面积和孔隙度,且粒度、孔径分布均匀。(3)有较高的回收率和负载量,能达到所需的分离效率,且重现性好。(4)层析剂应具有较好的热稳定性。(5)无毒性,分离过程不引起目的产物的变性或失活。(6)成本较低,价格合理。(一)无机基质层析剂1、硅胶:化学成分是二氧化硅,用作分离介质的硅胶是人工合成的多孔二氧化硅,其特点是表面含有很多硅羟基团,这是硅胶可以进行表面化学修饰或改性的基础。2、氧化铝:有碱性、中性和酸性之分。氧化铝通常用作吸附层析剂,且主要用于小分子有机化合物的分离。限制它更广泛应用的主要因素是,它难以像硅胶那样通过与硅羟基的键合作用而得到不同分离机理的层析剂。(一)无机基质层析剂(3)活性炭:活性炭分为粉末状活性炭和颗粒状活性炭两种。活性炭柱色谱特点:样品上柱量大,分离效果好,来源较易,价格便宜,适用于大量制备性的分离。但其吸附力不像氧化铝、硅胶那样容易控制,故应用不广。(4)多孔玻璃:主要成分也是二氧化硅,多孔玻璃的孔径可自数纳米至数微米间调整,且其孔径分布窄,机械强度也很高。同硅胶一样,多孔玻璃表面也含有丰富的硅羟基,因此它同样可以进行适当的化学修饰或表面处理,制得不同分离机理的层析剂。(一)无机基质层析剂(5)羟基磷灰石:是一种晶体形磷酸钙,与生物体有很好的相容性。羟基磷灰石层析剂可用于生物大分子的分离与纯化,近年来已成为水相体系中蛋白质、核酸和病毒等色谱分离应用最广的技术之一。羟基磷灰石表面有很多带电荷离子Ca2+和PO43-,它们能与蛋白质分子以带极性的偶极-偶极键合形式相结合。(二)有机基质层析剂与无机基质相比,有机基质材料具有如下特征:(1)基质微粒可广泛选择单体和交联剂聚合进行化学改性处理,所合成的层析剂产品普遍具有良好的选择性;(2)层析剂负载能力强,有较高的色谱容量;(3)具有良好的化学稳定性,可在广泛的pH范围内使用;(4)不易产生不可逆的吸附作用,特别是对于生化物质的分离能较好地保存其生物活性。常见的有机基质层析剂1、琼脂糖:琼脂糖是D-半乳糖和3,6-脱水-L半乳糖交替结合而成的链状多糖,是生物大分子物质色谱分离操作最常用的基质之一。由于琼脂糖颗粒中带有大量的-OH基团,不但亲水性好,而且可以方便地进行化学修饰,接上一些官能团,以便与某些接枝“手臂”或配基共价结合,适应于各种色谱分离技术。能用于色谱分离法的琼脂糖基质有许多商品,如Sepharose(Pharmacia)、BiogelA(Bio-rad)、UltrogelA(LKB等)。2.葡聚糖:葡聚糖(Dextran)是?-1,6健相连的葡萄糖聚合物。由环氧氯丙交联葡聚糖得到的珠粒,商品名称为Sephadex。由于多糖骨架上有大量羟基使得它的亲水性比Sepharose还强。凝胶的化学性质和热稳定性也很好。孔径较小的Sephadex主要用于脱盐、肽与其他小分子的分离;孔径较大的Sephadex用于蛋白质与其他大分子的分离。常见的有机基质层析剂3.纤维素:纤维素是?-1,4健相连的D-葡萄糖(偶尔有1,6键合)的线性聚合物。纤维素及其众多的衍生物已被广泛用于蛋白质类物质的纯化。尤其是内部具有不均匀球状结构的球状纤维素,具有很高的孔度和亲水性,机械强度比葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶都好。同样也可以进行化学修饰,以满足不同的需要。4.聚丙烯酰胺凝胶:是由丙烯酰胺与交联剂N,N’-甲叉双丙烯酰胺共聚得到。它具有烷烃的骨架和许多羧酰胺侧链。根据交联剂比例的不同,可得到不同孔度的网格。聚丙烯酰胺亲水性好,pH1-10范围内稳定,且不为生物降
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