蛋白质高效液相色谱技术.pptxVIP

高效液相色谱法在蛋白质

分离中的应用陈檬S1030624张双健S1030621郭传龙S1030622石晨阳S1030623汪菊芬S1030625

高效液相色谱技术特点概述1HPLC系统各组分介绍；2流动相的要求及准备过程354HPLC色谱技术与其他技术联用5HPLC应用举例6现状与展望6

高压应用范围广高灵敏度高效分析速度快HPLC是近二十年来发展起来的一项新颖快速的分离技术。它是在经典液相层析法基础上，引进了气相层析的理论具有气相层析的全部优点。特点

根据分离机理蛋白质HPLC又可分为高效凝胶过滤色谱(HPSEC)高效离子交换色谱（HPIEC）高效亲和色谱（HPAFC）反向高效液相色谱（RP-HPLC）

高效液相色谱仪

常用的HPLC仪Waters公司Agilent公司岛津公司等

进样系统进样方式隔膜进样停流进样阀进样自动进样DCAB

六通阀进样高效液相色谱系统中最理想的进样器，它是由圆形密封垫(转子)和固定底座(定子)组成。美国Rheodyne公司的六通阀进样器最为通用，各大HPLC仪器制造商均以此产品作为仪器的进样器。上样分析

淋洗液开始分析废液样品淋洗液至分离柱进样阀样品装样废液至分离柱定量环进样（ＬＯＡＤ）（ＩＮＪＥＣＴ）样品环

进样方式部分装液法进样量应不大于定量环体积的50%（最多75％），并要求每次进样体积准确、相同。缺点是易产生由进样引起的峰展宽完全装液法进样量应不小于定量环体积的5~10倍（最少3倍），这样才能完全置换定量环内的流动相，消除管壁效应，确保进样的准确度及重复性

二输液系统在线脱气装置梯度仪高压输液泵输液系统

高压输液泵流量稳定流量范围宽输出压力高液缸容积小密封性能好，耐腐蚀输液泵是HPLC系统中最重要的部件之一。其作用是将流动相以稳定的流速或压力输入到色谱系统。泵的性能好坏直接影响到整个系统的质量和分析结果的可靠性。

柱塞往复泵流量不受柱阻影响泵压可达400kg/cm2输出的脉冲性较大，现多采用双泵系统来克服液缸容积小，可至0.1ml，因此易于清洗更换流动相，特别适合再循环和梯度洗脱

三分离系统分离系统连接管恒温器色谱柱

色谱柱柱效高选择性好分析速度快

进入色谱柱样品的处理

柱的使用和维护注意事项色谱柱的正确使用和维护十分重要，稍有不慎就会降低柱效、缩短使用寿命甚至损坏。避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。应逐渐改变溶剂的组成。一般说来色谱柱不能反冲，会迅速降低柱效。

选择使用适宜的流动相（尤其是pH），以避免固定相被破坏。01需要对样品进行预处理或者在进样器和色谱柱之间连接一保护柱。02经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除保留在柱内的杂质。03柱的使用和维护注意事项

四检测系统

要求灵敏度高噪音低适用范围广重复性好

UV检测器

数据处理和计算机控制系统恒温装置在HPLC仪中色谱柱及某些检测器都要求能准确地控制工作环境温度，柱子的恒温精度要求在±0.1~0.5℃之间，检测器的恒温要求则更高。采集处理分析数据控制仪器色谱系统优化

流动相的要求反相色谱流动相以水作为基础溶剂，再加入一定量的能与水互溶的非极性调整剂，常用的是甲醇和乙腈。一般情况下甲醇-水已经能够满足多种样品的分离，粘度小，价格低。但推荐乙腈-水做初始实验，与甲醇比，乙腈的溶剂强度高粘度小，并可满足185-205nm处检测的要求。与检测器相适应溶剂的纯度粘度小沸点低固体残留物少与色谱系统相适应

流动相的准备调整PH根据所分离蛋白质及色谱柱决定流动相脱气滤膜过滤目前实验室主要用的是超声15min左右溶剂使用前都必须经0.45μm滤膜过滤，以除去杂质微粒。分清有机相滤膜和水相滤膜，对于混合流动相，在混合前过滤

合适的波长合适的柱温蛋白样品的性质

HPLC与其他色谱光谱技术的联用CEMSUFCECEMSHPLC

高效液相色谱—毛细管电泳当毛细管电泳与HPLC联用时，两者各自优势都得以发挥。HPLC—CE联用技术特别适合细胞或组织中蛋白质的分离高效液相色谱—质谱蛋白质组学和蛋白质酶谱研究的重要手段，通过质谱可以实现对蛋白质的自动分离检测。

反相高效液相色谱法对血清中胰岛素的测定应用实例色谱柱流动相梯度洗脱其他C5柱(100mm*4.6mm5μm，Ph-enomenex公司，美国A相:10mmol/LTris缓冲液(pH8.5);B相:乙腈;流速:1mL/minB相体积分数变化为:0～15min,15%～25.5%;15～21min,25.5%。进样量20μL柱温25℃

相信随着新的色谱柱和多种手段的联用，高效液相色谱能够在包括