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无载体无选择标记基因转化小麦：方法构建与应用探索

一、引言

1.1研究背景与意义

小麦作为世界上最重要的粮食作物之一，是人类重要的植物蛋白质来源，其种植面积和产量约占谷物种植面积的38%。在中国，小麦是仅次于水稻的第二大作物，对保障国家粮食安全起着举足轻重的作用。提高小麦的产量和品质，一直是农业科研和生产领域的核心任务。

长期以来，传统杂交育种途径在小麦品种改良中占据主导地位。然而，这种方法存在周期长、性状改良不显著和范围窄等缺点，难以满足日益增长的粮食需求和人们对高品质小麦的追求。随着科技的飞速发展，基因工程技术应运而生，为小麦品种的改良和优化开辟了新的道路。通过基因工程，可打破物种间的遗传限制，实现新品种的定向改良，创造出具有优良性状的小麦品种，如增强小麦的抗病、抗虫、抗逆能力，优化其加工品质等。

尽管基因工程技术为小麦改良带来了新希望，但传统的基因转化方法却存在诸多问题。在载体方面，常用的质粒载体等在转化过程中会引入一些不必要的DNA序列，这些序列可能会对小麦基因组的稳定性和表达调控产生未知影响，增加了基因转化的不确定性。在选择标记基因上，传统方法多采用抗生素抗性基因或除草剂抗性基因作为标记。一旦这些抗性基因通过花粉传播或其他途径扩散到环境中，可能会导致野生植物获得抗性，破坏生态平衡；同时，也引发了消费者对转基因食品安全性的担忧，阻碍了转基因小麦的推广应用。

因此，发展一种无载体无选择标记基因转化小麦的新方法具有迫切的现实需求和重要意义。从技术层面来看，该方法能有效减少基因转化中的不确定性，降低潜在的安全风险，提高基因转化的成功率和稳定性；从经济角度出发，简化的基因转化方法可节约大量的研究费用和时间成本，提高科研效率，推动小麦基因工程研究的快速发展；从产业发展角度而言，这一创新技术为小麦基因工程的开发提供了全新的思路和技术手段，有助于培育出更多优质、高产、安全的小麦新品种，促进小麦产业的可持续发展，对保障全球粮食安全和提升人们的生活水平具有深远影响。

1.2国内外研究现状

小麦遗传转化研究始于20世纪80年代末期，由于其基因组庞大（约17Gb）、重复序列多、再生能力差等特性，使得小麦的遗传转化相较于其他作物更为困难，基因工程育种进程也明显落后。但随着基因枪的问世、新的选择标记基因和高效启动子的运用，自1991年以后，小麦转基因研究开始逐渐增多。

早期的小麦基因转化主要依赖于基因枪法。1992年，Vasil等率先利用基因枪介导法，以小麦幼胚愈伤组织为受体材料，成功将bar基因导入小麦，获得了世界上第一例转基因小麦植株，自此拉开了小麦基因转化研究的序幕。随后，Weeks、Nehra等人也相继利用基因枪介导法将GUS基因、bar基因导入小麦，逐步建立起基因枪转化小麦幼胚的技术体系。众多科研团队在此基础上不断深入研究，如Becker等将GUS基因和bar基因同时导入小麦；Zhou等导入CP4基因和GOX基因；Altpeter、Ortiz、Takumi、Witrzens等分别将GUS基因、bar基因、CP基因和hpt基因转入小麦，进一步完善了该技术体系。在品质改良方面，Altpeter、Blechl、Barro、陈梁鸿、Rooke等分别将编码高分子量谷蛋白亚基1Ax1、1Dx5、1Dy10基因导入小麦，为小麦加工品质的提升提供了新途径；在抗病虫领域，徐惠君将Nib8复制酶基因导入小麦，梁辉导入GNA基因，Okubara导入FsTRI101基因，使转基因小麦对黄花叶病毒病、蚜虫和赤霉病表现出较强抗性或一定抗性。为了提高基因枪转化小麦幼胚的效率，Pellegrineschi对129个Bobwhite姊妹系进行转化能力鉴定，发现部分姊妹系在特定处理下转化率高达60.8%-73.8%；Taiichi以水稻乙酰乳酸合酶突变体作为筛选标记，基因枪转化小麦基因型BobwhiteS-26新鲜幼胚，转化率达16.7%。然而，基因枪介导法存在诸多弊端，如转化效率较低、插入外源DNA片段不明确、导入大片段DNA困难、成本高以及操作复杂等。并且，用于基因枪转化的外源目标基因需构建到质粒载体上，而表达载体上除目标基因表达盒外，通常还携带植物筛选标记基因表达盒（如bar基因、hpt基因、nptII基因等）和细菌筛选标记基因表达盒（如bla基因、aadA基因、nptII基因等）等骨架序列，这些多余元件给转基因植物的进一步试验和评价带来了隐患。为解决这一问题，Fu设计了基因枪介导的最小表达框转化技术，即从表达载体上酶切回收包括启动子、目标基因和终止子在内的目标基因表达框，与标记基因载体或表达框混