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DNMT1对目的基因mRNA表达水平影响的初步研究
摘要
本初步研究旨在探索DNA甲基转移酶1(DNMT1)对目的基因mRNA表达水平的影响。通过构建DNMT1过表达和敲低细胞模型,运用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测目的基因mRNA的表达变化。研究结果显示,DNMT1过表达会显著降低目的基因mRNA的表达水平,而DNMT1敲低则导致目的基因mRNA表达水平显著升高。本研究为进一步深入探究DNMT1在基因表达调控中的作用机制提供了初步数据支持,有助于理解相关生物学过程及疾病发生发展机制。
关键词
DNMT1;目的基因;mRNA表达水平;实时荧光定量PCR
一、引言
DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰方式,在基因表达调控、胚胎发育、肿瘤发生发展等众多生物学过程中发挥着关键作用。DNA甲基转移酶1(DNMT1)作为维持DNA甲基化的关键酶,能够在DNA复制过程中识别半甲基化DNA,并将甲基基团转移至新合成的DNA链上,从而保持DNA甲基化模式的稳定传递。已有研究表明,DNMT1异常表达与多种疾病的发生发展密切相关,如癌症中DNMT1的过表达常导致抑癌基因甲基化沉默,进而促进肿瘤的发生和进展。然而,DNMT1对特定目的基因mRNA表达水平的影响尚未完全明确,尤其是在不同细胞类型和生物学背景下。因此,开展本研究,初步探究DNMT1对目的基因mRNA表达水平的影响,对于揭示基因表达调控的表观遗传机制、阐明相关疾病的发病机理具有重要意义。
二、材料与方法
(一)细胞培养
选取人源HeLa细胞作为研究对象,在含有10%胎牛血清(FBS)、1%青霉素-链霉素的DMEM培养基中,置于37℃、5%CO?的恒温培养箱中培养。定期观察细胞生长状态,当细胞汇合度达到80%-90%时,进行传代培养或实验处理。
(二)DNMT1过表达和敲低细胞模型构建
过表达模型:购买携带DNMT1基因的过表达慢病毒载体(LV-DNMT1)及对照慢病毒载体(LV-Control)。将处于对数生长期的HeLa细胞接种于6孔板中,待细胞汇合度达到50%-60%时,按照慢病毒感染说明书,分别加入LV-DNMT1和LV-Control慢病毒,感染复数(MOI)设为10,同时加入终浓度为8μg/mL的聚凝胺(Polybrene)以提高感染效率。感染6小时后,更换新鲜培养基,继续培养48小时。通过嘌呤霉素(1μg/mL)筛选7-10天,获得稳定过表达DNMT1的HeLa细胞株(HeLa-DNMT1)及对照细胞株(HeLa-Control)。
敲低模型:设计针对DNMT1的短发夹RNA(shRNA)序列及非特异性对照shRNA序列,构建重组慢病毒载体(LV-shDNMT1)和对照载体(LV-shControl)。同样将HeLa细胞接种于6孔板,在合适汇合度下进行慢病毒感染,MOI设为10,加入聚凝胺,感染后处理及筛选过程同过表达模型,最终获得稳定敲低DNMT1的HeLa细胞株(HeLa-shDNMT1)及对照细胞株(HeLa-shControl)。
(三)RNA提取与cDNA合成
分别收集HeLa-DNMT1、HeLa-Control、HeLa-shDNMT1和HeLa-shControl细胞,使用TRIzol试剂按照说明书提取总RNA。通过分光光度计测定RNA浓度和纯度,确保A260/A280比值在1.8-2.0之间。取1μg总RNA,利用反转录试剂盒进行反转录反应,合成cDNA,-20℃保存备用。
(四)实时荧光定量PCR(qRT-PCR)
以合成的cDNA为模板,使用SYBRGreen荧光染料法进行qRT-PCR。根据目的基因和内参基因GAPDH的序列设计特异性引物(引物序列见表1),引物由专业公司合成。反应体系为20μL,包括10μL2×SYBRGreenMasterMix、0.5μL上游引物(10μmol/L)、0.5μL下游引物(10μmol/L)、1μLcDNA模板和8μLddH?O。反应条件为:95℃预变性30秒;95℃变性5秒,60℃退火30秒,共40个循环;最后进行熔解曲线分析,以确保扩增产物的特异性。每个样本设置3个技术重复,采用2?ΔΔCt法计算目的基因mRNA的相对表达量。
基因名称
上游引物(5-3)
下游引物(5-3)
目的基
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