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免疫组化（IHC）必备的四大对照设置指南

在免疫组化实验中，抗体的选择、多重荧光标记方案的设计以及成像分析往往是研究者的关注重点。但若忽视实验对照的设置，

实验结果的可信度和可重复性将大打折扣。以下是膜蛋白专家Alomone总结的四大关键对照类型，助您获得精准可靠的实验数

据。

一、一抗阴性对照（NoPrimaryControl）

适用场景：间接法检测（一抗+标记二抗体系）

操作方式：实验流程中仅省略一抗孵育步骤，其余步骤不变。

作用解析：若此时仍出现阳性信号，提示二抗存在非特异性结合（如与组织内源性免疫球蛋白结合）。此对照可快速验证二抗

的特异性，必要时需更换二抗。

二、阻断肽对照（BlockingPeptideControl）

原理：利用过量抗原肽（免疫原）与一抗预孵育，竞争性封闭其抗原结合位点。

操作方式：将一抗与阻断肽按比例混合后孵育，再按常规流程染色。

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结果判读：若目标信号显著减弱或消失，表明一抗特异性良好；若仍有染色，则提示抗体存在脱靶结合（如交叉反应或非特异

性吸附）。

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维可提供的跨膜蛋白抗体相关BlockingPeptide

三、阴阳性组织对照

•阳性组织对照

选择依据：已知目的蛋白高表达的组织（如肿瘤标志物在肿瘤组织中的表达）。

验证意义：若阳性对照未显色，需排查抗体失效、抗原修复失败或实验操作问题。

•阴性组织对照

理想样本：基因敲除（KO）或敲低（KD）组织。

替代方案：若无法获取KO/KD样本，可参考蛋白质图谱数据库（如TheHumanProteinAtlas），选择目标蛋白天然低表达

或不表达的组织作为对照。

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验证意义：若阴性对照染色，则很可能是抗体的非特异性结合

四、内源性背景对照

很多组织会天然产生一定程度的背景染色或自发荧光。胶原蛋白和弹性蛋白是主要干扰源，此外嗜酸性粒细胞、脂褐素及某些

胚胎组织（如卵黄）也会造成类似问题。

针对组织自发荧光或内源物质干扰，建议采取以下策略：

预判本底：拍摄未染色样本的自发荧光，明确背景干扰区域。

固定优化：使用丙酮甲醇（11）混合固定液，可降低部分组织自发荧光。

淬灭剂处理：苏丹黑等染料可淬灭特定波长荧光，但可能影响目标信号强度。

光谱校正：多色荧光实验时，通过光谱拆分区分目标信号与背景。

实验对照的设置是数据解读的重要依据，也是不同批次实验结果可比性的基石。对于诊断级IHC，建议参考Torlakovic等学者

提出的标准化方案（PMID。若需抗体特异性验证，可遵循Uhlen团队提出的五支柱验证法

（https///10.1038/nmeth.3995）。

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