酶组织化学总论.pptxVIP

酶的组织化学

一.概述酶是生物体内具有催化作用的特殊蛋白质高效性103-106倍专一性低反应条件易变性失活降低生化反应的反应活化能

分子生物学，免疫化学法等广义上说，任何一种可以测定反应物变化速度的分析技术，都可用来测定酶活性容量法（量气法）比色法与分光光度法荧光法与同位素法离子选择电极法，旋光法030405060102酶活性的检测方法

酶的组织化学利用细胞内的酶具有催化底物的特性，并通过显色反应在切片或涂片上显示组织或细胞中内源性酶的活性及其定位的方法

目前，用酶组织化学方法能显示的酶已达100余种免疫酶组织化学电镜酶组织化学1939年Takamatsu、Gomori碱性磷酸酶1970年Sternberger酶标抗体法1955年Scheldon酸性磷酸酶1940-1960年1868年Klebs组化酶组织化学发展历史

02氧化还原酶转移酶水解酶裂解酶异构酶合成酶01酶的种类

酶的特性01酶的定位02酶组织化学的基本原理03二.酶组织化学反应的基本知识

水溶性，易扩散，难溶或不溶于有机溶剂有机溶剂不同程度降低酶的活性易受温度影响，对热耐受性弱对干燥耐受性强（一）酶的特性

2019酶在细胞内或超微结构中存在的特定部位0120205‘-核苷酸酶——浆膜022021ATPase——肌球蛋白032022细胞膜线粒体04（二）酶的定位

同时保存结构和酶的活性保存酶的定位，防止酶的扩散或移位保证反应产物的特异性影响酶活性的因素：温度PH值抑制剂激活剂(三）酶组化的基本条件

（四）原理及一般原则

细胞内的酶催化分解合适的底物，生成中间产物（即初级反应产物）01然后其中之一再与辅助物（或捕捉剂）反应，生成有色不溶性的终反应产物02该反应产物沉积在原位，以显示酶的存在031.基本原理

第一反应：酶促反应底物初级反应产物（PRP）第二反应：捕捉反应PRP+捕捉剂终反应产物（FRP）123酶4

底物在酶催化下水解的速度PRP在缓冲液中的弥散系数PRP与辅助物反应的速度应选择合适的底物和辅助物,减少弥散捕捉剂的浓度（1mg/ml）010302PRP弥散：

所有参与反应的试剂均不能与其他成分吸附或结合对组织处理,制片过程不能影响酶的活性及分布所选底物和辅助物必须迅速,同步穿透入组织和细胞中所选底物最好只能被一种酶催化分解所选辅助物不影响细胞内酶的活性,不影响其他反应试剂的穿透性PRP必须迅速与辅助物反应,FRP为水不溶性的有色稳定产物0304050601022.一般原则

酶的固定（fixation）酶的特异性反应（specificreaction）在最适条件下,酶反应产物的沉着（precipitation）使沉着物具有可见性（visualization）组织/细胞制作切片酶反应（孵育）显色封片镜检(五)酶组织化学的主要步骤

检测方法的选择01酶的保存与固定02一般新鲜组织快速冷冻,冰冻切片0370℃长期保存04固定剂051-4%多聚甲醛,福尔马林,戊二醛06固定时间07固定方法:浸泡固定灌流固定08固定温度:0—4℃09（六）各步骤注意问题

（六）各步骤注意问题3.切片制作:切片厚度40um4.缓冲液选择缓冲液用于A.配置固定液B.漂洗液C.配置酶反应孵育液选择缓冲液应注意A.不能减弱目标酶的活性B.不能含有与捕捉机制相同的物质C.注意漂洗用缓冲液的渗透压D.漂洗用缓冲液原则上与固定液配置的缓冲液相同

1孵育液配置2孵育的温度和时间:37℃15-30min3切片孵育法-切片孵育漂浮孵育（六）各步骤注意问题孵育反应

酶特异性对照实验用酶活性抑制剂采用无底物的孵育液过固定或加热用针对目标酶的激活剂改变孵育液底物选择最适PH酶细胞内的定位差异12（六）各步骤注意问题

孵育后,后固定脱水超薄切片后染色电镜检查酶孵育后进行后固定脱水封片,镜检孵育后操作光镜:电镜:（六）各步骤注意问题或与检测有关物质的扩散最终反应产物的扩散吸附现象反应阴性（六）各步骤注意问题人为产物及其原因

三.显示酶的组织化学方法金属离子沉淀法一般用于显示磷酸酶

β-甘油磷酸钠磷酸酯+Ca++磷酸钙磷酸钴硫化钴（