组化和免疫组化染色结果的定量测定.pptxVIP

第十四章.组化和免疫组化染色结果的定量测定(TheQuantitationAssayofHistochemistryImmunohistochemistryStaining)将组化,免疫组化和原位杂交等的染色结果分析提高到定量水平.最常用的有图像分析术(Imageanalysistechnique),显微分光光度术(Microspectrophotometrytechnique),流式细胞术,(Techniqueofflowcytometry,FCM)和激光扫描共聚焦显微镜术(Techniqueoflaserscanningconfocalmicroscopy,LSCM)等.

I.图像分析术A.目测半定量:依据反应产物的面积和颜色深浅,主观性大.B.图像分析仪(Imageanalyzer):又称图像分析系统.1.主要结构和工作原理:a.显微镜:获取染色结果的光学信息.b.图像输入装置:摄像机或扫描器,将光学信息输入电脑.c.电脑:将光学信息转换成电子信息.将光学信号的灰度分为256级可发现染色深浅的微小差别.彩色有两种:真彩色(Realcolor)是指标本染色的真实颜色,而假彩色(Pseudocolor)是指将不同灰度转换成不同的颜色以增强对比度.d.输出装置:显示器或打印机等给出图象表面几何形状测量(体积/面积/表面积/长度等)和图象密度测量(数目)等客观数据.

c.必要时要进行图像的加工处理,如阳性区选择和图像切割等.2.应用:定量给出组织细胞形态的几何参数和组织结构(包括宏观和微观)的特征性参数,从平面测量推算到空间参数和组织结构的三维图像重建.3.注意事项:a.照片高质量高倍.对照组照片的放大倍数应相同.b.复染会影响灰度值的准确性.

左侧睾丸和附睾体部精子结合抗原蛋白异构体11(SPAG11E)免疫组化染色.西安交通大学医学院解剖与组胚专业博士生田宏.2010.左侧睾丸:A.左侧假手术对照组;B.精索静脉曲张(ELV)2周组周;C.ELV4周.附睾体部:D.左侧假手术对照组;E.ELV2周;F.ELV4周.

ELV大鼠睾丸和附睾SPAG11E免疫组化灰度值测定结果:睾丸:ELV2周和4周组SPAG11E蛋白的平均灰度值与其相应的对照组比较未见明显改变(P0.05);01附睾:ELV2周和4周组SPAG11E蛋白的表达均较同期对照组显著减弱(P0.05或P0.01),ELV4周组附睾SPAG11E蛋白的表达较ELV2周组显著减弱(P0.01).02

简介:细胞分光光度计(cytospectrophotometer),是一种以物质分子对光波的选择性吸收为基础,对生物样品中的化学物质进行定量测定的精密仪器.通过测定核酸,蛋白质,脂类,酶类或其它化学成分的光吸收和微区面积而计算它们的相对含量.主要结构和工作原理:光源:有白炽灯和汞灯,疝灯.白炽灯可作为标准光源,辐射光谱在400~700nm间,用于一般测量.汞灯为激发荧光的理想光源,疝灯的辐射光谱在250~1100nm间.单色器和滤光片:保证进入显微镜的光波亮度充足,波长单一且可调.光电组合件:将测量区内的光学信号转变为电子信号,产生测量数据.II.显微分光光度术

C.基本步骤:标本制备:凡是显示细胞内化学物质的各种组化和免疫组化染色标本均可用显微分光光度计对单个细胞进行定量测定,但标本内不能有双重染色且染色要保持均匀一致.

2.测量方法:#2022

III.流式细胞术#2022

信号检测系统:测定细胞发出荧光的角度,波长和大小,可知细胞的体积和细胞内某种物质的含量.控制系统:校准调节上述系统.

C.样品染色:绝大多数用荧光染料进行标记.DNA含量:溴化乙啶(EB)和碘化丙啶(PI)嵌插入DNA的双螺旋;神光霉素与G-C有特异性;Hoechst33258与A-T有特异性;吖啶橙(Acridineorange,AO)可以同时染色DNA和RNA.细胞核:DAPI(4,6-二脒基-2-苯基吲哚)是专与细胞核结合的荧光素.蛋白质含量:一般用异硫氰酸荧光素(FITC).外周T,B和单核细胞以及T细胞的亚群分选:结合特异性单克隆抗体.

D.应用举例:肿瘤学(Oncology):绝大多数肿瘤从空间与时间上都显示出稳定的多倍体DNA含量,而且常常是非整倍体数.FCM能诊断异常的DNA干系,可作为指导肿瘤的治疗,了解病情发