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酶联接免疫吸附测定

酶联接免疫吸附测定,Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay，简称ELISA，是

以免疫学反应为基础，将抗原抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结

合起来的一种敏感性很高的实验技术。自上世纪70年代初问世以来，发展十分迅

速，目前已被广泛应用于生物学、医学的许多领域。

根据检测时标本以及检测目的等的不同，具体可以设计出不同类型的ELISA

方法，如间接法、双抗夹心法、双位点一步法、竞争结合等。

本教材以检测待测标本中肿瘤坏死因子TNFα的含量介绍双抗体夹心ELISA

法。其基本原理是：

抗人TNFα单克隆抗体被固相化在酶标板上，所加入标本中的抗原TNFα被酶

标板上的单克隆抗体所捕获，通过洗涤以去除多余的或结合不牢固的抗原；被捕

获的TNFα再与加入的生物素化的抗人TNFα二抗结合，通过洗涤以去除多余的或

结合不牢固的二抗；生物素再与加入的亲和素-HRP结合，通过洗涤以去除多余

的或结合不牢固的亲和素-HRP，HRP与最后加入的底物反应，形成有色产物，

产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量

分析。

实验前准备

实验开始前，需准备好实验所需的各种试剂和耗材：

TNFα的ELISA检测试剂盒为：HumanTumorNecrosisFactorαELISAKit。

此试剂盒中包含了实验所需的所有主要试剂。

主要仪器和耗材有：ThermoScientific全波长扫描式多功能读数仪、芬兰百

得的各个量程单通道移液器，赛默飞公司的QSP盒装吸头及冰盒等。

接下来进入实验部分，本实验操作流程是：样品的稀释；样品与捕获抗体的

孵育；洗涤；二抗孵育；洗涤；亲和素-HRP孵育；洗涤；底物显色；OD值的

检测；标准曲线的绘制与标本中TNFα浓度的计算。

样品稀释

预先将冻干的人TNFα标准品溶解在适量超纯水中，溶解成浓度为

2000pg/ml母液。

取8只1.5ml离心管，做好浓度标记，分别是：1000、500、250、125、62.5、

31.2、15.6、0pg/ml。分别吸取200μl的样品稀释液至8个离心管中，取200μl的标

准品母液至第1个离心管中，漩涡混匀后吸取200μl至第2个离心管中，同样漩涡

混匀后吸取200μl至第3个离心管中，依次稀释至第7个离心管，最后一个标记为

零的离心管不含标准品，作为空白对照。

免疫反应

实验中所用到的试剂均需预先从冰箱中取出，室温恢复至常温。

按每孔50μl往已包被了人TNFα单抗的酶标板中加入各组样品，每组样品2至

3个复孔，首先加入1个空白对照样、然后是7个浓度的标准品、最后是两个稀释

倍数的待测样品。加完后轻轻拍打酶标板数次混匀。注意：标准品按浓度梯度依

次加样，并且做好各个样品的标记。

用盖板膜小心盖好酶标板，确保所有的边缘已密封好，室温孵育1h。

孵育结束后，小心去除板盖膜，吸去板内液体，用PlateWashing洗涤酶标

板3次，将整个酶标板倒置在吸水纸上，轻轻拍板以去除残余液体。

按每孔100μl加入已稀释好的生物素标记TNFα二抗。

盖板膜小心盖好酶标板，确保所有的边缘已密封好，室温孵育1h。

孵育结束后，小心去除板盖膜，吸去板内液体，用PlateWashing洗涤酶标

板3次。将整个酶标板倒置在吸水纸上，轻轻拍板以去除残余液体。

按每孔100μl加入亲和素-HRP，盖板膜小心盖好酶标板，室温避光孵育

30min。

孵育结束后，小心去除板盖膜，去除板内液体，用PlateWashing洗涤酶标

板3次。将整个酶标板倒置在吸水纸上，轻轻拍板以去除残余液体。

按每孔100μl加入TMB显色底物，室温避光反应30min。

30min后，每孔加入100μlStopSolution终止反应，终止后孔内液体呈现橙黄

色。

终止后于波长492nm处立即进行OD值的检测。

吸光值测定：

打开ThermoScientificSkanltSoftware软件，点击“Newsession”新建程序，给

程序命名后，点击“Next”；根据所用的酶标板型号选择微孔板