流式细胞分析分选原理.pptxVIP

流式细胞仪工作原理

流式细胞术的原理流式细胞术（FCM）是一种能对单个细胞、分子和生物颗粒（微生物）进行多参数快速检测的新型分析和分选技术。近几年随着多种单克隆抗体的成功制备和多种荧光素的应用。FCM逐步运用于对疾病诊断和治疗监测的临床检验常规工作。

流式细胞仪与显微镜光源激光自然光、灯光、氙(汞)灯对象细胞、生物粒子细胞、生物粒子承载工具载(盖)玻片鞘液及流动室检测信号光学信号形态及染色放大方式PMT，放大电路目镜X物镜统计人工，200计算机，5000结果简单，单参数多参数，综合分析

01流路流动室 鞘液SHEATH样本流SAMPLE单细胞悬液5*105~1*106个/ml02光路光源检测信号光电倍增管PMTHV03电路放大电路HV及GAIN增益A/D转换统计：计算机基本原理

流式细胞仪光路流路电子软件DCAB

流路光路电路/电子软件

这一过程,成为流体动力学聚焦单细胞悬液大多数仪器是在50-300μm大小的孔径中,将细胞悬液注射进入鞘液中流路

FLOWCELLInjectorTipFluorescencesignalsFocusedlaserbeamSheathfluid

流路光路电路/电子软件

光路光源检测信号散射光信号FS:前向角散射光SS:侧向角散射光(90度散射光)荧光信号荧光染料光学滤片颜色补偿12

01与通过的细胞聚焦在同一点上光源02空冷 488nmblue,633nmred,325nmUV,514nmgreen,水冷Innova300系列 Innova70系列固态激光光路

检测信号

散射光信号—前向散射光(FS)FSForward(AngelLight)Scatter在激光束正前方的检测器,为前向散射光检测器FS的强度与细胞或其他颗粒的大小,形状及opticalhomogeneity有关FS用于检测细胞或其他粒子的表面属性如:大小

前向散射光

No.3SS-Side(AngelLight)Scatter与激光束垂直方向的检测器为侧向检测器,也称为90度散射光检测器SS的强度与细胞或其他颗粒的大小,形状及opticalhomogeneity有关SS用于检测细胞内部结构如:胞浆内颗粒多少,核质比No.2No.1散射光信号–侧向散射光

侧向散射光

90DegreeScatter02004006008001000815203040501002001000LymphocytesMonocytesNeutrophilsSideScatterProjectionLightScatterGatingScale

每种荧光染料均有特定的激发波长,并激发后会有发射波长,流式细胞仪检测的即是它特定的发射波长.01利用各种不同波长的光学滤片来收集(检测)这些光学信号02光路-荧光信号

激发波长(EXCITING)发射波长(EMISSION)荧光染料的特性

Fluorescenceemittedbyeachfluorochromeisusuallydetectedinauniquefluorescencechannel.Thespecificityofdetectioniscontrolledbythewavelengthselectivityofopticalfiltersandmirrors.

Absorptionspectrum:RangeoverwhichafluorescencecompoundmaybeexcitedEmissionspectrum:Rangeofemittedwavelengthsforaparticularcompound

FITC/PE/ECD/PC5/PC7ColorSingleLaser(488nm)

4ColorSingleLaser(488nm)

FITC/PE/ECD/PC5

常用荧光染料的特性荧光染料激发波长(nm)发射波长(nm)用途颜色FITC488525免疫荧光绿色PE(RD1)488575免疫荧光橙色ECD488620免疫荧光橙红PeCy