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赤羽病三种快速检测方法的构建与应用研究

一、引言

1.1赤羽病概述

赤羽病（Akabanedisease），又被称为阿卡斑病，是一种由布尼病毒科（Bunyaviridae）布尼病毒属（Orthobunyavirus）的阿卡斑病毒（Akabanevirus，AKAV）引发的病毒性传染病。该病毒于1959年在日本群马县赤羽村的牛棚中被首次收集并分离出来，故而得名赤羽病毒。

阿卡斑病毒粒子呈现球形，具备囊膜结构，其基因组由负链单股RNA构成，包含3个核衣壳，分别由核衣壳蛋白和少量大蛋白包裹大（L）、中（M）、小（S）3种RNA。在病毒的结构蛋白里，G蛋白作为诱导机体产生中和抗体的主要保护性抗原，同时也是结构蛋白中变异较大的蛋白；N蛋白上存在3个抗原表位，具有群特异性，同样能够刺激机体产生抗体。虽然目前普遍认为AKAV仅存在一个血清型，但通过对L、N和MmRNA的系统发生分析发现，世界各地区的AKAV流行株至少可分为3个基因群，即亚洲群、澳洲群和其它群，呈现出显著的遗传多样性。最近，Stram的研究还发现，从以色列分离出的AKAV与上述3个基因群的遗传距离都较远，属于一个全新的基因群，被称为第4基因群。

赤羽病主要影响牛、羊等反刍动物，尤其对怀孕的牛、绵羊和山羊危害巨大，围产期的胎儿极易受到感染。其临床症状主要表现为流产、早产、死胎、胎儿畸形、木乃伊胎以及新生胎儿发生关节弯曲积水性无脑综合症（简称AH综合征）。感染赤羽病的孕牛，通常不会出现体温反应和明显的临床症状，特征性表现为妊娠牛异常分娩，多发生在怀孕7个月以上或接近妊娠期满的牛。感染初期，胎龄越大的胎儿早产情况越多；中期容易发生难产，即便顺产，新生犊牛也难以站立；后期则多产出无生活能力的犊牛或瞎眼犊牛。绵羊在怀孕1-2个月内感染本病毒后，会产生畸形羔羊，如关节弯曲、脑积水和无脑症等。病理变化主要体现为胎儿体形异常，如关节、脊柱和颈骨弯曲等，大脑缺损、脑形成囊泡状空腔、躯干肌肉萎缩并变白。

赤羽病在全球范围内广泛分布，呈地方性流行态势。在澳大利亚、日本、美国、韩国、肯尼亚、南非以及中国台湾省等地均有发生的报道。在我国，近年来北方地区（尤其是东北地区）部分牛羊养殖场也出现了赤羽病，给养殖者带来了较大的经济损失。由于活牛跨区域运输频繁，该病存在向其他地区扩散的风险，特别是南方吸血昆虫较多的地区，需加强对该病的防控。

1.2研究目的与意义

本研究旨在构建三种针对赤羽病的快速检测方法，分别为环介导等温扩增技术（LAMP）、荧光定量PCR技术和胶体金免疫层析技术。通过对这些方法的优化和验证，期望实现对赤羽病的快速、准确检测。具体目标包括：确定各检测方法的最佳反应条件，评估其灵敏度、特异性和重复性；建立标准化的操作流程，以便在基层兽医实验室和养殖场中推广应用；通过对实际样本的检测，验证所建立方法在赤羽病诊断中的可行性和有效性。

快速检测方法对于赤羽病的防控具有至关重要的意义。赤羽病主要通过吸血昆虫传播，具有明显的季节性，感染后通常不会让健康牛表现出明显症状，但会严重影响胎儿发育，导致妊娠母牛流产、胎儿畸形等问题，给养牛业带来巨大经济损失。由于目前国内没有成熟的疫苗，加强检测成为防控赤羽病的关键环节。快速检测方法能够在疫病早期及时发现感染动物，为疫情的及时控制提供依据，有助于防止疫病的进一步扩散。

在实际养殖中，快速检测方法可以帮助养殖场及时发现潜在的感染牛群，采取隔离、淘汰等措施，减少经济损失。对于新引进的牛只，通过快速检测可以有效防止带毒牛进入养殖场，保障牛群的健康。在疾病诊断方面，现有的检测方法如病原学鉴定和血清学试验，存在操作复杂、耗时较长等问题，难以满足实际需求。本研究建立的快速检测方法具有操作简便、快速准确的特点，能够在短时间内得出检测结果，为兽医临床诊断提供有力支持，有助于提高赤羽病的诊断效率和准确性，推动赤羽病防控工作的有效开展。

二、赤羽病检测技术研究现状

2.1传统检测方法的局限

传统的赤羽病检测方法主要包括病毒分离鉴定和血清学检测。病毒分离鉴定是将采集的样本接种到敏感细胞或实验动物中，观察病毒的生长和繁殖情况，从而确定是否存在赤羽病毒。这种方法虽然是诊断赤羽病的“金标准”，但存在诸多局限性。一方面，病毒分离鉴定需要专业的实验室设备和技术人员，操作过程复杂，对实验条件要求严格，如细胞培养需要无菌环境、适宜的温度和湿度等。另一方面，病毒分离鉴定的时间较长，通常需要数天甚至数周才能得到结果，难以满足临床快速诊断的需求。而且，样本中的病毒含量较低或存在其他干扰因素时，病毒分离的成功率会大大降低，容易出现假阴性结果。

血清学检测是通过检测动物血清中的抗体来判断是否感染赤羽病毒，常用的方法