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基因突变检测规范

一、基因突变检测概述

基因突变检测是利用分子生物学技术，识别生物体基因组中发生变异（如点突变、插入/缺失、拷贝数变异等）的方法。其应用广泛，涵盖遗传病诊断、肿瘤靶向治疗、药物基因组学等领域。为确保检测结果的准确性、可靠性和临床适用性，必须遵循统一的操作规范。

二、基因突变检测流程

（一）样本采集与处理

1.样本类型：常用样本包括外周血（EDTA抗凝）、唾液、组织活检样本等。

2.采集要求：

-外周血样本需避免溶血，采集量≥5mL。

-唾液样本采集前清洁口腔，避免食物残留。

-组织样本需新鲜，避免自溶或污染。

3.保存与运输：

-血液样本需在4℃条件下保存，24小时内送检。

-唾液样本可常温保存，但需防污染。

（二）DNA提取与质量控制

1.提取方法：常用方法包括苯酚-氯仿法、试剂盒法（如磁珠法、柱法）。

2.质量评估：

-DNA纯度（A260/A280比值应为1.8–2.0）。

-DNA浓度需≥20ng/μL（可根据后续实验调整）。

-通过琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性（主带亮度，无降解）。

（三）基因突变检测技术

（1）PCR-based检测

1.实时荧光PCR（qPCR）：

-适用于单点突变检测（如Sanger测序验证后的热点基因）。

-需设计特异性引物，优化退火温度（60–65℃）。

2.数字PCR（dPCR）：

-高灵敏度检测低频突变（如肿瘤ctDNA检测）。

-通过绝对定量避免PCR扩增效率误差。

（2）高通量测序（NGS）

1.全外显子组测序（WES）：

-适用于复杂遗传病或肿瘤胚系/体细胞突变分析。

-需选择商业或定制捕获试剂盒（覆盖率≥80%）。

2.目标区域测序（TRseq）：

-精确检测已知基因热点（如BRCA1/2、EGFR）。

-流程包括文库构建、二代测序（Illumina平台）。

（四）数据分析与解读

1.生物信息学分析：

-变异检测工具（如GATK、Samtools）。

-筛选标准：变异频率＞1%，功能预测（SIFT、CADD评分）。

2.临床意义分级：

-分为致病性、可能致病性、良性及意义不明（VUS）。

三、检测质量控制与验证

1.内对照设置：

-每批次需加入已知突变样本（如c.151TA，BRCA1基因）进行验证。

2.重复性测试：

-同一样本连续检测3次，变异检出率需≥95%。

3.盲样测试：

-由第三方机构提供未知样本，评估检测准确性。

四、临床应用注意事项

1.样本污染防范：

-操作间需符合ISO15189标准，避免交叉污染。

2.报告规范：

-明确检测范围、技术方法、变异分类及临床建议。

3.伦理要求：

-保护患者隐私，涉及遗传信息需获得知情同意。

五、总结

基因突变检测需严格遵循样本处理、DNA提取、技术选择、数据分析和质量控制的全流程规范。标准化操作可有效降低误差，确保检测结果的科学性和临床价值。

三、基因突变检测流程（续）

（一）样本采集与处理

1.样本类型：

-外周血（EDTA抗凝）：最常用，适用于多种基因检测，如肿瘤体细胞突变、遗传病胚系分析。采集要求：使用含EDTA的采血管（如Lancet或蝶翼针），避免用力挤压穿刺点，血液量至少5mL（用于PCR）或10mL（用于NGS）。

-唾液样本：无创替代方案，适用于外显子组测序或易位检测。采集方法：使用商业唾液采集管（如Oragene），指导受试者含服刺激剂（如棉签），收集≥4mL唾液，常温保存或-20℃冷冻。

-组织活检样本：适用于肿瘤靶向治疗或遗传咨询。要求：手术获取新鲜组织（≥20mg），立即置于RNAlater溶液或冻存管中，-80℃保存。

2.样本保存与运输：

-血液/唾液：4℃条件下运输，24小时内完成DNA提取。若延迟检测，需-20℃冷冻，避免反复冻融。

-组织样本：需在2小时内完成RNA/DNA提取，否则需-80℃保存。运输时使用干冰保持温度。

（二）DNA提取与质量控制

1.提取方法：

-苯酚-氯仿法（实验室自制）：

步骤：

(1)加入等体积氯仿：异戊醇（体积比24:1），剧烈振荡混匀。

(2)4℃离心（12,000rpm，10分钟），取上清液。

(3)加入3/4体积无水乙醇，-20℃沉淀DNA（30分钟）。

(4)4℃离心（10,000rpm，5分钟），弃上清，用70%乙醇洗涤。

(5)空气干燥后溶解于TE缓冲液。

-试剂盒法（推荐）：

常用品牌：QiagenDNeasyBloodKit、PromegaMagNeasyBloodKit。

操作流程：

(1)血液裂解：加入裂解