副鸡嗜血杆菌单克隆抗体的制备及阻断ELISA检测方法构建与应用研究.docxVIP

副鸡嗜血杆菌单克隆抗体的制备及阻断ELISA检测方法构建与应用研究

一、引言

1.1研究背景与意义

鸡传染性鼻炎（Infectiouscoryza，IC）是由副鸡嗜血杆菌（Haemophilusparagallinarum，Hpg）引起的一种鸡的急性呼吸系统传染病，主要症状为鼻腔和窦发炎、打喷嚏、流泪、结膜炎、鼻腔流出黏液，严重时可导致面部肿胀、呼吸困难。该病在全球范围内广泛传播，尤其在密集养殖的鸡场中发病率较高，给养鸡业带来了巨大的经济损失。

在我国，鸡传染性鼻炎的发生也较为普遍。据相关报道，近年来我国多个地区都有鸡传染性鼻炎的病例出现，且发病范围呈扩大趋势。如河南、山东、河北等地的鸡场都曾遭受该病的侵袭，造成了严重的经济损失。副鸡嗜血杆菌感染鸡群后，会导致蛋鸡产蛋量大幅下降，下降幅度可达10%-40%，同时还会使育成鸡生长发育受阻，肉鸡增重缓慢，淘汰鸡数量显著增加。此外，该病还常与其他病原体混合感染，如鸡毒支原体、大肠杆菌等，进一步加重病情，提高死亡率，给养鸡业带来更为沉重的打击。

目前，鸡传染性鼻炎的诊断主要依靠临床症状、细菌分离培养和血清学检测等方法。然而，临床症状容易与其他呼吸道疾病混淆，难以准确判断；细菌分离培养要求高，操作复杂，需要专业的技术和设备，且耗时较长；传统的血清学检测方法如平板凝集试验、血凝抑制试验等，虽然操作相对简单，但存在特异性和敏感性较低的问题，容易出现误诊和漏诊。因此，开发一种快速、准确、灵敏的检测方法对于鸡传染性鼻炎的防控具有重要意义。

单克隆抗体（Monoclonalantibody，McAb）具有特异性强、灵敏度高、可大量制备等优点，在疾病诊断、治疗和预防等方面得到了广泛应用。利用单克隆抗体制备的阻断酶联免疫吸附试验（Blockingenzyme-linkedimmunosorbentassay，B-ELISA），能够有效提高检测的特异性和敏感性，可用于全群检测筛选，及时发现感染鸡只，从而采取有效的防控措施，防止疫情的扩散。

本研究旨在制备副鸡嗜血杆菌的单克隆抗体，并建立相应的阻断ELISA检测方法，为鸡传染性鼻炎的快速诊断和防控提供技术支持。通过本研究，有望提高鸡传染性鼻炎的诊断准确性和效率，为养鸡业的健康发展提供有力保障，具有重要的理论意义和实际应用价值。

1.2国内外研究现状

在国外，对副鸡嗜血杆菌的研究起步较早。自1920年Beach首次对鸡传染性鼻炎进行报道，1931年DeBlieck成功分离出病原以来，国外学者围绕副鸡嗜血杆菌的生物学特性、致病机制、诊断方法和疫苗研发等方面展开了广泛研究。在单克隆抗体制备方面，一些研究通过杂交瘤技术成功制备出针对副鸡嗜血杆菌的单克隆抗体，并对其特性进行了深入分析，这些单克隆抗体为副鸡嗜血杆菌的检测和研究提供了有力工具。在检测方法上，除了传统的细菌分离培养、血清学检测方法外，分子生物学技术如PCR、核酸探针等也逐渐应用于副鸡嗜血杆菌的检测，显著提高了检测的灵敏度和特异性。

国内对副鸡嗜血杆菌的研究始于20世纪80年代，冯文达于1987年首先在北京分离到副鸡嗜血杆菌，证实了该菌在我国的存在。此后，国内学者针对副鸡嗜血杆菌的流行病学、分离鉴定、药敏特性等进行了大量研究。在单克隆抗体制备方面，张文文等以副鸡嗜血杆菌A型和C型株经灭活后作为抗原，免疫BALB/c小鼠，成功制备出9株针对副鸡嗜血杆菌的特异性单克隆抗体，并建立了阻断ELISA检测方法。林艳等通过分离藏鸡副鸡嗜血杆菌，对其16SrDNA序列进行分析，为副鸡嗜血杆菌的分子鉴定提供了依据。

然而，当前的研究仍存在一些不足。一方面，现有的单克隆抗体和检测方法在特异性和敏感性方面仍有待进一步提高，以满足临床快速、准确诊断的需求；另一方面，对于副鸡嗜血杆菌的致病机制和免疫保护机制的研究还不够深入，这限制了新型疫苗和诊断试剂的研发。此外，不同地区副鸡嗜血杆菌的流行菌株存在差异，需要针对本地流行菌株制备特异性的单克隆抗体和检测方法。

1.3研究目标与内容

本研究的目标是成功制备出针对副鸡嗜血杆菌的高特异性、高灵敏度的单克隆抗体，并基于此单克隆抗体建立一套稳定、可靠的阻断ELISA检测方法，用于鸡传染性鼻炎的快速、准确诊断，为养鸡业的疫病防控提供有力的技术支持。具体研究内容如下：

副鸡嗜血杆菌单克隆抗体的制备：筛选合适的副鸡嗜血杆菌菌株，经过培养、灭活等处理后作为免疫原。选取健康的BALB/c小鼠，按照既定的免疫程序进行多次免疫，以刺激小鼠的免疫系统产生针对副鸡嗜血杆菌的特异性抗体。在免疫完成后，取小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合，通过融合技术获得杂交瘤细胞。采用间接ELISA和直接平板凝集试验等方法对杂交