尿酸氧化酶基因在汉逊酵母中的表达及发酵优化：从理论到实践.docxVIP

尿酸氧化酶基因在汉逊酵母中的表达及发酵优化：从理论到实践

一、引言

1.1研究背景

尿酸氧化酶（UrateOxidase，UOX），又称为尿酸酶，在生物体内嘌呤降解代谢途径里扮演关键角色，能够催化尿酸氧化，生成尿囊素、二氧化碳与过氧化氢。在众多物种中都存在尿酸氧化酶，可在高等哺乳动物（如猿和人类）体内，却缺乏具备生物活性的尿酸氧化酶，因此尿酸成为了嘌呤代谢的最终产物。随着对血液中尿酸研究的深入，发现尿酸水平和痛风、高血压、血管病、糖尿病、肾脏病以及诸多临床综合症存在关联，这些疾病或病理状态相互影响，可能互为因果，也可能产生协同效应。比如，高尿酸水平是引发痛风的关键因素，长期的高尿酸血症会致使尿酸盐结晶在关节及周围组织沉积，进而引发炎症反应，导致关节疼痛、肿胀等痛风症状。而且，尿酸氧化酶作为检测血液中尿酸浓度的关键试剂，在临床检测中作用重大，检测数据的准确性在很大程度上依赖于尿酸氧化酶的稳定性和可靠性。在临床治疗方面，尿酸氧化酶能够快速降低血液中的尿酸含量，其治疗作用也受到了广泛关注，在痛风、高尿酸血症和肿瘤溶解综合征等疾病的治疗中被广泛应用。

在痛风治疗领域，尿酸氧化酶可以使尿酸迅速氧化，快速降低尿酸水平，加速痛风石溶解，从而有效控制痛风发作。目前临床上常用的重组型尿酸氧化酶，如拉布立酶和普瑞凯希。拉布立酶能够降低98%-100%患者的尿酸水平，降尿酸作用较强，不过作用时间仅18个小时，需要多次注射，且容易快速产生抗体，致使药物失活，部分患者应用过程中还会出现溶血性贫血或者高铁血红蛋白血症，这在一定程度上限制了其临床应用，主要用于防治血液病或者恶性肿瘤放化疗过程中导致的急性高尿酸血症；普瑞凯希与拉布立酶相比，过敏反应较小，作用时间较长，可以降低80%难治性痛风患者的尿酸水平，但也存在比较严重的心血管不良事件、过敏以及耐药等问题，且价格昂贵，临床应用同样受到限制。由此可见，开发高效、安全且成本可控的尿酸氧化酶生产技术具有重要的现实意义。

微生物是尿酸氧化酶的重要来源，目前已从细菌、酵母菌和丝状真菌等多种微生物中分离出尿酸氧化酶。然而，天然来源的尿酸氧化酶受到产酶条件及产酶水平的限制，难以满足商业化生产的需求。比如，一些野生型菌株的尿酸氧化酶产量较低，发酵过程中容易受到环境因素的影响，导致酶的产量和质量不稳定，分离纯化过程也较为复杂，成本较高，这些因素都制约了尿酸氧化酶的大规模生产和应用。为了解决这些问题，尿酸氧化酶的异源表达逐渐成为研究热点。

在众多可用于异源表达的宿主中，汉逊酵母（Hansenulapolymorpha）作为一种甲醇营养型酵母，展现出诸多优势，成为了理想的表达宿主之一。汉逊酵母是单细胞低等真核生物，具有易培养、繁殖快的特点，能够在较短时间内获得大量菌体，为工业化生产提供了有利条件。而且，汉逊酵母在生长过程中不会产生毒性代谢产物，对生产环境和产品质量安全无不良影响。它还可耐受50℃高温，对金属胁迫和氧胁迫等多种环境胁迫具有更高的耐受性，这使得在发酵过程中能够适应更复杂的环境条件，保证发酵的稳定性和持续性。在蛋白表达方面，汉逊酵母能对外源蛋白进行与高等真核生物类似的翻译后加工和修饰，可降低重组蛋白质的免疫原性风险，使其表达的重组蛋白更接近天然蛋白的结构和功能，有利于提高蛋白的生物活性和稳定性。当以甲醇为唯一碳源或同时存在低浓度甘油时，汉逊酵母中与甲醇代谢相关的基因可以被高效诱导表达，其中一系列可被甲醇高效诱导的强启动子，如moxp、fmdp等，被广泛应用于高效表达外源蛋白，能够实现外源基因的高水平表达，提高尿酸氧化酶的产量。汉逊酵母是公认的安全微生物（generallyrecognizedassafe,GRAS），已被国家食品药品监督管理局（CFDA）批准认可为医药用重组蛋白表达宿主，在生物制药领域具有广阔的应用前景。

在乙肝疫苗生产领域，利用汉逊酵母表达系统生产的乙肝疫苗展现出了卓越的性能。汉逊酵母能够大量生产乙肝表面抗原（HBsAg），且抗原的免疫原性更强，通过该系统生产的疫苗，避免了血源性疫苗可能存在的病毒污染风险，安全性更高。临床试验显示，汉逊酵母乙肝疫苗的抗体阳转率可达99%，抗体滴度超过1000mIU/ml，显著高于其他技术路线的疫苗。在《20-49岁成人乙型肝炎疫苗不同免疫程序的免疫原性比较》研究中表明，在10μg剂量下，汉逊酵母乙肝疫苗的抗体阳性率比CHO细胞和酿酒酵母乙肝疫苗高出10个百分点，抗体滴度是后两者的3倍，充分证明了汉逊酵母在表达外源蛋白方面的优势。此外，大连化物所周雍进团队以多形汉逊酵母为宿主，通过优化甲羟戊酸途径、增加NADPH和乙酰CoA的供应以及下调竞争途径，实现了β-榄香烯的高水平生产，工程菌