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免疫分析技术之ELISA广东省功能蛋白质组学重点实验室王娟

免疫学检测技术020103测定各类免疫球蛋白、补体、细胞因子及其受体、黏附分子的表达水平和生物活性，从而了解机体免疫因子间的相互关系分子水平体外（或体内）测定各类细胞及其亚群的数量和效应，从而了解机体的细胞免疫水平细胞水平测定免疫应答相关基因的表达与调控、免疫分子的遗传多态性及基因型别分析基因水平

酶联免疫吸附实验（EnzymeLinkedImmuno1SorbentAssay，ELISA），是在免疫酶技术(immunoenzymatictechniques)上发展起来的一种新型免疫测定技术，基础是：抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析。2ELISA概念

酶免疫测定酶免疫测定类型液相酶免疫测定均相酶免疫测定酶免疫组化酶免疫技术这种固相酶免疫测定方法在1971年最初建立时称为酶联免疫吸附剂测定，简称ELISA。非均相酶免疫测定固相酶免疫测定

1.1抗原抗体反应可逆性抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡，其反应式为：Ag+Ab→Ag·Ab抗体的亲和力（affinity），可以用平衡常数K表示：K=[Ag·Ab]／[Ag][Ab]，Ag·Ab的解离程度与K值有关。高亲和力抗体的抗原结合点与抗原的决定簇在空间构型上非常适合，两者结合牢固，不易解离。解离后的抗原或抗体均能保持原有的结构和活性。

抗原抗体的结合发生在抗原的决定簇与抗体的结合位点之间。化学结构和空间构型互补关系，具有高度的特异性。测定某一特定的物质，而不需先分离待检物。特异性

化学比色法的敏感度为mg/ml水平免疫测定中凝胶扩散法和浊度法的敏感度与酶反应法相仿标记的免疫敏感度可提高数千倍，达ng/ml水平例如，HBsAg，其敏感度可达0.1ng/ml。酶反应测定法的敏感度约为5-10μg/ml0102030405敏感性

1.2免疫测定在临床检验中的应用由于各种抗原成份，包括小分子的半抗原，均可用以制备特异性的抗血清或单克隆抗体，利用此抗体作为试剂就可检测标本中相应的抗原，因此免疫测定的应用范围极广。

使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。1使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。2在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。3由于酶的催化频率很高，故可极大地地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。4基本原理

2ELISA的类型ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂：固相的抗原或抗体，即免疫吸附剂（immunosorbent）；酶标记的抗原或抗体，称为结合物（conjugate）；酶反应的底物。可设计出各种不同类型的检测方法。

2.1双抗体夹心法测抗原A.?????将抗体吸附于固相表面；B.?????加抗原，形成抗原-抗体复合物；C.????加酶标抗体；D.加底物。底物的降解量＝抗原量。此法适用于检测各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP等。只要获得针对受检抗原的特异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。

2.2双抗原夹心法测抗体用特异性抗原进行包被和制备酶结合物。此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。乙肝标志物中抗HBsAg的检测常采用本法。本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。

2.3间接法测抗体A.?????将抗原吸附于固相载体表面；B.?????加抗体,形成抗原-抗体复合物;C.?????加酶标抗体；D.加底物。测定底物的降解量＝抗体量传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。

2.4竞争法测抗体当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。

2.5竞争法测抗原小分子抗原或半抗原缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，最后的显色也愈