卫生微生物检测的基本技术.pptVIP

第1页，共24页，星期日，2025年，2月5日一、实验目的1、掌握无菌操作、平板制备、接种、革兰氏染色及镜检技术。2、熟悉革兰氏染色的原理。3、了解革兰氏染色在细菌分类鉴定中的重要性。第2页，共24页，星期日，2025年，2月5日二、实验仪器与材料大肠杆菌、芽胞杆菌革兰氏染色液载玻片显微镜等第3页，共24页，星期日，2025年，2月5日三、实验内容第4页，共24页，星期日，2025年，2月5日1、无菌技术火焰周围10厘米第5页，共24页，星期日，2025年，2月5日液体培养基接种：接种环退出前，靠几下管壁，抖掉接种环上的菌液。接种环从后往前烧。半固体培养基：穿刺接种接种针中间垂直接近管底，但是不能刺穿0.5-1cm0.2-0.7%2、接种第6页，共24页，星期日，2025年，2月5日固体培养基：平板划线接种，斜面划线接种从斜面底部向上划一条直线。，再从底部向上Z形来回密集划线，不能划破。第7页，共24页，星期日，2025年，2月5日染色标本制备3、革兰氏染色第8页，共24页，星期日，2025年，2月5日革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家ChristainGran创立的，基本步骤是：1、初染：结晶紫染色2、媒染：碘液媒染3、脱色：95%乙醇脱色4、复染：番红复染第9页，共24页，星期日，2025年，2月5日实验原理：细菌对革兰氏染色的不同反应是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。初染后，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫—碘的复合物，增强染料与细菌的结合力。第10页，共24页，星期日，2025年，2月5日当用脱色剂处理时，革兰氏阳性菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，壁厚、类脂质含量低，用乙醇脱色时细胞壁脱水，使肽聚糖层的网状结构孔经缩小，透性降低，从而使结晶紫—碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂质含量高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫—碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。第11页，共24页，星期日，2025年，2月5日步骤1：涂片用接种环滴加1-2环或滴一小滴生理盐水，挑取少量菌种与玻片上的水滴混匀后，在载玻片上涂布成一均匀的薄层，菌膜直径在0.5~1cm。火烤，酒精棉球如果水多了，菌挑多了，接种环灭菌从后往前第12页，共24页，星期日，2025年，2月5日步骤2：干燥涂好的菌膜在室温下自然干燥。也可在酒精灯上方稍微加热（10cm），但不能紧靠火焰。步骤3:固定手持载玻片的一端，菌膜面向上，在火焰最热部分迅速通过2-3次，待玻片冷却后方可染色。第13页，共24页，星期日，2025年，2月5日结晶紫染色1min水洗，用滤纸吸干。刚好覆盖为宜水洗时，不要直接冲菌膜面，而应使水从载玻片的一端流下，水流不宜过急，以免涂片薄膜脱落。步骤4:染色第14页，共24页，星期日，2025年，2月5日碘液媒染1min，水洗，滤纸吸干。95%酒精脱色20-30s，水洗，滤纸吸干。滴加：轻轻摇动，一般30s流加：流出的乙醇无紫色。第15页，共24页，星期日，2025年，2月5日番红复染1-2min，水洗，滤纸吸干。第16页，共24页，星期日，2025年，2月5日染色结果步骤5:镜检干燥后，油镜观察。以分散开的细菌颜色为准。第17页，共24页，星期日，2025年，2月5日