免疫分析及免疫传感器讲课文档.pptVIP

免疫分析及免疫传感器;放射免疫分析：放射活性物半衰期短、损害健康、污物难处理等

光学免疫分析：对于有色样品及不纯样品检测的灵敏性有一定限制

电化学免疫分析及免疫传感器：快速、简便、经济等特点，微型化，均相检测;本章主要介绍一些基础背景知识，包括抗体结构和抗体-抗原相互作用，这对所有采用特殊的免疫分析模式的免疫分析和免疫传感器来说，都是至关重要的因素。重点介绍电化学免疫分析和免疫传感器的发展现状，以便能够比较容易地理解该领域取得的成就，并加以应用。;4.2抗体-抗原相互作用;;;

根据氨基酸排列顺序的不同分为：

可变区(VariableRegion）和恒定区（ConstantRegion）

可变区（V区）：氨基酸组成、排列顺序变化较大

恒定区（C区）：氨基酸数量、种类、排列顺序及含糖量都比较稳定

;铰链区;图4.1抗体Y型结构示意图。介于重链和轻链之间的区域即为抗原结合区域，“Y”型的开臂部分记为F(ab)2,而底部无抗原结合活性的区域记为Fc。;其中，K为反应平衡时的速率常数；Ab-Ag为抗体-抗原复合物。K的范围为106~1012Lmol-1，通常只有亲和常数K较大的抗体（≥108Lmol-1）显示较低的交叉反应性。;单克隆抗体特别适用于免疫分析。单克隆抗体是由单一细胞系合成的，因此具有相同的抗原决定簇特异性和亲和性，是可以大量制备的均质抗体。与多克隆抗体相比，单克隆抗体显示更高的特异性和均质性，可减少纯化步骤。

;;4.3免疫分析及免疫传感器;免疫分析;免疫的原理;免疫学检测历史演进;4.3.1酶联免疫法;酶免疫测定或免疫酶技术是指酶标记抗体或酶标记抗体进行的抗原抗体反应。它主要包括两个方面：

免疫过氧化物酶法：以过氧化物酶作为标记，与抗原或抗体结合，然后根据酶与其底物间所产生的不溶性颜色产物，借助于光学或电子显微镜观察细胞及亚细胞水平的抗原或抗体。

酶联免疫吸附法（ELISA)：根据可溶性抗原或抗体与不溶性固相载体结合后，还保留其免疫活性，结合了作为标记的酶催化作用。;ELISA的基本原理和方法;4.3.1.1基本原理

它采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜???反应，用于定量测定。测定的对象可以是抗体也可以是抗原。

在这种测定方法中有3种必要的试剂：

①固相的抗原或抗体（免疫吸附剂）

②酶标记的抗原或抗体（标记物）

③酶作用的底物（显色剂）

;测量时，抗原（抗体）先结合在固相载体上，但仍保留其免疫活性，

然后加一种抗体（抗原）与酶结合成的偶联物（标记物），此偶联物仍保留其原免疫活性与酶活性，

当偶联物与固相载体上的抗原（抗体）反应;颜色反应的深浅与相应的抗体或抗原量成正比，因此可借助于颜色反应的深浅来定量抗体或抗原。

这种有色产物可用肉眼、光学显微镜、电子显微镜观察，也可以用分光光度计（酶标仪）加以测定。

其方法简单，方便迅速，特异性强。;4.3.1.2酶及其底物

酶结合物是酶与抗体或抗原,半抗原在交联剂作用下联结的产物。是ELISA成败的关键试剂，它不仅具有抗体抗原特异的免疫反应，还具有酶促反应，显示出生物放大作用，但不同的酶选用不同的底物，将得到不同的颜色反应。;酶;4.3.1.3ELISA的种类和变化;（一）双抗体夹心法;步骤：

A将已知抗体吸附于载体上，温育后清洗；

B加入待检标本溶液，使溶液中的抗原与吸附的抗体结合，温育后清洗；

C加入酶标记特异性抗体，温育后清洗；

D加入酶作用底物，产生显色反应，颜色的改变与所加的待检标本溶液中的抗原量成正比。;;;（二）间接法;步骤：

A将已知可溶性抗原吸附于载体（聚苯乙烯板或聚乙苯乙烯小珠），经温育后清洗；

B加入待检稀释血清，若血清中有相应特异性抗体存在则与吸附的抗原结合，温育后清洗；

C加入酶标记的抗球蛋白抗体，此时酶标记抗抗体与吸附的抗原抗体复合物结合，温育后清洗；

D加入酶作用底物（或称基质），酶分解底物并显色，用光电比色计测定底物显色深浅，即可推知抗体量。;;;（三）竞争法;步骤：

A将已知抗体吸附于固相载体表面，温育后清洗；

B将可能含抗原的待检溶液和酶标记的已知抗原溶液以适当比例混合，加入已包被的载体孔中，温育后清洗；

C加入酶作用的底物，产生显色反应。色深表示结合的酶标记抗原多，而待检溶液中未标记的抗原量少；反之，色浅表示结合的酶标记抗原少，而待检溶液中抗原量多。;;;对照管由于只加酶标抗原，与固相抗体充分结合，故分解底物显色深；测定管的显色程度则随待测抗原和酶标抗原与固相抗体竞争结合的结果而异。如待测抗原量多，竞争性地抑制酶标抗原与固相抗体结合，使固相上结合的酶标抗原量减少。因此，加