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石蜡切片制作技术规范

一、引言

石蜡切片技术是组织学、病理学及相关生命科学研究中最常用的技术手段之一，其通过将组织标本包埋于石蜡中，制成薄片后进行染色观察，为形态学研究、疾病诊断及科学探索提供了坚实的基础。本规范旨在系统阐述石蜡切片制作的标准流程、关键控制点及操作要点，以确保获得高质量、可重复的切片标本，为后续的实验研究和诊断工作提供可靠保障。规范的操作不仅能有效保留组织的形态结构，还能减少人为误差，提升实验结果的准确性与可信度。

二、组织固定

组织固定是石蜡切片制作的首要环节，其目的在于迅速终止组织细胞的生命活动，防止其自溶与腐败，尽可能保持组织在活体状态下的形态结构和化学成分。

（一）固定液选择

应根据组织类型、研究目的及后续染色方法选择适宜的固定液。中性缓冲福尔马林是目前应用最为广泛的常规固定液，其对组织穿透性强，固定均匀，能较好地保存细胞形态和抗原性。对于某些特殊组织或特殊染色需求，可选用乙醇、丙酮、Bouin液等其他固定液。

（二）固定操作要点

1.取材及时：组织离体后应尽快投入固定液中，避免组织自溶。

2.固定液用量：固定液的体积应为组织块体积的10-20倍，以确保固定效果。若组织块较大，应适当增加固定液用量或在固定过程中更换固定液。

3.组织块大小：一般而言，组织块的厚度不宜超过3毫米，面积不超过2平方厘米。过大过厚的组织块会导致中心固定不良。必要时，可对较大组织进行适当切割。

4.固定时间：固定时间需根据组织类型、大小及固定液种类进行调整。常规组织块用中性缓冲福尔马林固定，时间通常为6-24小时。固定时间不足易导致组织固定不全，过长则可能引起组织过度硬化或抗原破坏。

5.振荡与通气：对于一些致密组织或较大组织块，适当的振荡或在固定液表面覆盖纱布以增加通气，有助于提高固定效率。

（三）固定后处理

组织固定完成后，若不能立即进行后续处理，应转入相应的保存液中冷藏保存，或用流水冲洗以去除残留固定液（如福尔马林固定后需流水冲洗，时间依组织大小而定，通常为几小时）。

三、组织脱水

脱水的目的是利用脱水剂将组织内的水分置换出来，为后续的透明和浸蜡创造条件。

（一）脱水剂选择

乙醇是最常用的脱水剂，具有脱水能力强、价格低廉等优点。此外，丙酮也可作为脱水剂，其脱水速度快，但对组织的硬化作用较强。

（二）脱水程序

脱水应按照从低浓度到高浓度的梯度进行，逐步置换组织内的水分，避免组织因急剧脱水而发生收缩、变形。典型的乙醇脱水梯度如下：

1.低浓度乙醇：通常从70%乙醇开始，停留一定时间。

2.中浓度乙醇：依次经过80%、90%乙醇。

3.高浓度乙醇：最后进入95%乙醇（通常两次，以确保彻底脱水）和无水乙醇（通常两次）。

（三）脱水时间控制

各级乙醇的脱水时间需根据组织的类型、大小、密度以及脱水剂的种类进行调整。一般而言，每级乙醇的处理时间为1-3小时。对于较硬或较大的组织，可适当延长时间；而对于较软或较小的组织，则可缩短时间。关键在于确保组织在每一级都能充分脱水，但又不过度脱水导致组织变脆。

（四）注意事项

1.脱水剂应定期更换，以保证其脱水能力。

2.避免组织在低浓度乙醇中停留时间过长，以防组织变软、膨胀。

3.无水乙醇具有较强的吸水性，应注意密封保存，防止吸收空气中的水分而降低浓度。

四、组织透明

透明是指利用透明剂置换组织内的脱水剂，使组织变得透明，同时也能使石蜡更容易渗透到组织内部。

（一）透明剂选择

二甲苯是最常用的透明剂，其透明能力强，速度快，且能与乙醇及石蜡混溶。但二甲苯具有一定的毒性和挥发性，操作时需注意通风。其他透明剂还包括苯、氯仿、香柏油等，可根据具体情况选用。

（二）透明程序与时间

透明通常也是梯度进行，或直接进入二甲苯。一般经过1-2级二甲苯处理。透明时间同样需根据组织类型、大小及透明剂种类调整，通常每级30分钟至1小时。透明时间过短，透明不彻底，影响浸蜡；时间过长，则可能导致组织过度硬化、变脆，甚至出现裂隙。

（三）透明终点判断

组织达到完全透明，即组织内部无白色不透明区域，表明透明完成。

五、组织浸蜡

浸蜡是将已透明的组织置于熔化的石蜡中，使石蜡逐渐渗透到组织的各个部分，取代透明剂，为后续的包埋做准备。

（一）石蜡选择

应选用熔点适宜的石蜡。常用的石蜡熔点为52-58℃，可根据气候条件和组织类型选择。夏季可选用熔点较高的石蜡，冬季可选用熔点较低的石蜡。对于某些特殊要求，还可使用混合蜡（如石蜡与蜂蜡混合）以改变其硬度和韧性。

（二）浸蜡程序与温度控制

浸蜡应在恒温蜡箱中进行，温度应设定在高于石蜡熔点2-3℃的范围内，以保证石蜡处于良好的熔融状态，但温度不宜过高，以免烫伤组织、破坏细胞结