专题5课题3血红蛋白的提取和分离.docx

专题5课题3血红蛋白的提取和别离导学案

一、根底知识

〔一〕凝胶色谱法

1、凝胶色谱法也称做，是根据别离蛋白质的有效方法。

2、凝胶实际上是一些微小的球体，这些小球体大多数是由构成的，如葡聚糖或琼脂糖。

3、在小球体内部有许多贯穿的通道，相对分子质量不同的蛋白质分子通过凝胶时速度不同，相对分子质量的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程，移动速度；而相对分子质量的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在移动，路程，移动速度，即分子量大的分子先从层析中流出来。因此相对分子质量不同的蛋白质得以别离。

思考1：如右图，a和b为大小不同的蛋白质，洗脱时，哪个先从层析柱中流出来？为什么？

思考2：你能从凝胶色谱的别离原理分析为什么凝胶的装填要严密、均匀吗？

〔二〕缓冲溶液

1、缓冲溶液的作用是。

2、缓冲溶液通常由溶解于水中配制而成的。如磷酸缓冲液〔Na2HPO4/NaH2PO4〕

〔三〕电泳

1、电泳是指。

2、许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团会带上。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷的电极移动。电泳利用了待别离样品中各分子的差异以及分子本身的、的不同，使带电分子产生不同的，从而实现样品中各种分子的别离。

思考：带电荷越多，体积越小，迁移的速度是越快还是越慢？

3、两种常用的电泳方法是和，在凝胶中参加SDS，电泳速率完全取决于。

二、实验操作

蛋白质的提取和别离一般分为四步：、、和。

〔一〕样品处理

1、红细胞的洗涤：生理盐水洗涤红细胞的目的是，采集的血样要及时别离红细胞，别离时采用离心〔500r/min〕，然后用胶头吸管吸出上层透明的，将下层暗红色的倒入烧杯，再参加五倍体积生理盐水，缓慢搅拌10min，低速短时间离心，如此重复洗涤三次，直至，说明红细胞已洗涤干净。SHAPE

注：为了防止血液凝固，要预先参加抗凝血剂_________________。

思考3：兔成熟红细胞、鸡成熟红细胞，优先选哪种材料做实验？为什么？

2、血红蛋白的释放：在和作用下，红细胞破裂释放出血红蛋白。

3、别离血红蛋白溶液：将搅拌好的混合溶液离心〔2000r/min〕后，试管中的溶液分为4层。第一层为无色透明的，第2层为白色薄层固体，是，第3层是红色透明液体，这是，第4层是的暗红色沉淀物。将试管中的液体用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。

〔二〕粗别离：透析

取1mL的血红蛋白溶液装入中，将透析袋放入盛有300mL的物质的量的浓度为20mmol/L的〔PH=7.0〕中，透析12h。透析袋能使_________自由进出，而大分子留在袋内。透析可以去除样品中的杂质，或用于更换样品的缓冲液。

〔三〕纯化——凝胶色谱法进展别离纯化

〔四〕纯度鉴定——SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定并进展相对分子质量测定

思考4：与其他真核细胞相比，红细胞有什么特点？这对蛋白质别离有什么意义？

稳固练习

1、利用凝胶色谱法，什么样的蛋白质先洗脱出来()

2、蛋白质提取和别离分为哪几步()

A.样品处理、凝胶色谱操作、SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳B.样品处理、凝胶色谱操作、纯化

C.样品处理、粗别离、纯化、纯度鉴定D.样品处理、纯化、粗别离、纯度鉴定

3、用凝胶色谱法别离蛋白质时，分子量大的蛋白质()

A．路程较长，移动速度较慢B.路程较长，移动速度较快

C.路程较短，移动速度较慢D.路