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植物生理学实验

希尔反应的观察和反应速率的测定

摘要：

本实验以新鲜的菠菜叶片为实验材料；以菠菜的离体叶绿体为实验对象，由离体叶绿体悬浮液在光下能还原某些氧化剂，根据2,6?-二氯酚靛酚在光下从蓝色到粉红色再到无色的变化，观察希尔反应。在本实验中观察到，加入叶绿体悬浮液的试管，在光下由蓝色变为绿色（由于叶绿体存在的原因）；暗处的试管仍为蓝色。

实验原理与实验目的

实验原理：

希尔发现，离体叶绿体悬浮液在光下能还原某些氧化剂（如2,6-二氯酚靛酚、高铁氰化钾、苯醌、NADP+、草酸等）2H2O+2A→2AH2+O2

希尔反应的测定的方法是（1）放氧速率；（2）氧化剂被还原的速率。本实验中2,6-氯酚靛酚还原后，溶液由兰色变为无色。

实验目的：

观察和测定希尔反应，了解叶绿体在光合放氧中的作用。

实验材料和方法

实验材料：菠菜

实验器材：离心机、分光光度计、天平、研钵、漏斗、容量瓶、量筒、烧杯、纱布、移液管、台灯等

实验试剂：（1）提取液（0.067M磷酸缓冲液，pH6.5+0.3M蔗糖+0.01MKCl）；（2）0.1%2,6-二氯酚靛酚（溶于0.067M磷酸缓冲液+0.01%KCl）

实验步骤

1.离体叶绿体悬浮液的制备

称取8克叶片,加10ml预冷提取液研磨,在研钵中捣碎30秒钟后,继续加入15ml冷提取液;

经过二层纱布过滤,去残渣,挤出滤液,置于离心管中。

以1000转/分离心3分钟;弃去沉淀。

以3000转/分离心上层液,8分钟,弃去上清液,沉淀为破碎的叶绿体。

用20ml提取液悬浮沉淀,置于冰浴备用。

2.离体叶绿体对2,6-二氯酚靛酚的还原作用

取2支试管，分别加入5ml叶绿体悬浮液和1ml0.1%的2,6-二氯酚靛酚。一试管照光，另一试管置于黑暗。5-10min后观察溶液颜色的变化。

实验结果与讨论

实验结果：

黑暗处的试管颜色未发生变化，一直都是蓝绿色；?

光照下的试管颜色明显变浅，由较深的蓝绿色变为浅绿色，证明希尔反应的存在，可见离体叶绿体悬浮液在光下能还原某些氧化剂。

实验讨论：

离体叶绿体对染料的还原作用实验中,比较两个处理的溶液颜色有何不同,并解释实验结果。

答：现象：两份叶绿体悬浮液，分别加入1ml0.1%的2,6-二氯酚靛酚后，一份在光照条件下，一份在黑暗条件下；在黑暗条件下的叶绿体悬浮液一直是蓝绿色的；而在光照条件下的叶绿体悬浮液在加入1ml0.1%的2,6-二氯酚靛酚后为蓝绿色，而放在光下一段时间后叶绿体悬浮液又慢慢变为原来的颜色，浅绿色。

原因：这是由于叶绿素在光照条件下被激活，而释放出电子，从而还原某些氧化剂。2,6-二氯酚靛酚本来是蓝色的，加入后使得叶绿素提取液变为蓝绿色，而2,6-氯酚靛酚还原后，溶液变为无色，这时叶绿素提取液又变为原来的颜色，浅绿色。

参考文献：

王英典，刘?宁.?植物生物学实验指导?.?北京：高等教育出版社.（第2版）