乳酸乳球菌体内合成及整合吡咯赖氨酸途径的构建及应用.pdfVIP

摘要

乳酸链球菌素(Nisin)是由某些乳酸乳球菌产生的一种羊毛硫抗菌肽。由于

其生物安全性，Nisin也是少数几种被FDA批准作为食品添加剂的抗菌肽。最

新研究还发现了Nisin在抗肿瘤和抗炎等方面的潜力。在活细胞蛋白质中位点特

异性插入非天然氨基酸(noncanonicalaminoacids,ncAAs)的遗传密码子扩展方法

近年来被广泛应用，该方法所涉及的生物体系包括细菌、病毒及真核细胞等。

这些ncAA含有多样的功能侧链基团，如叠氮基、炔基、烯基、酰胺基、硝基、

磷酸根、磺酸根等，可进行多种生物正交反应。在活细胞中，运用正交氨酰

tRNA合成酶/tRNA对解码无义密码子，可以将这些ncAA精确的掺入到特定位

置，为研究活细胞内蛋白质的结构与功能提供了有效的方法。但是外源添加

ncAA成本较高，不利于工业上重组蛋白的生产，因此ncAA生物合成途径在细

胞中的建立很有必要。

实现蛋白质中的特异性位点掺入ncAA需要正交氨基-tRNA合成酶/tRNA对,

以及无义密码子（通常是琥珀密码子TAG）。本文采用来自Methanosarcina

barkeriMS的MbPylRS/tRNACUA对，此正交对在原核生物、酵母哺乳动物中都

是正交的。本研究首先将MbPylRS/tRNACUA对引入到Nisin高产菌株F44中，

以实现在F44中的密码子扩展，并以插入TAG的GFP作为报告基因，验证了

ncAA在报告基因的掺入。在添加ncAA后，重组蛋白表达量有显著提升，从而

验证了乳酸乳球菌F44中密码子扩展系统的成功构建。通过探究培养基中

ncAA的添加量与密码子扩展系统效率的关系发现，培养基中最佳ncAA添加量

为1mM。本研究还发现密码子扩展系统对宿主菌株几乎不会产生生长影响。

在表达MbtPylRS/tRNACUA对的F44中引入吡咯赖氨酸（Pyl）的从头合成

途径，并调节唯一前体赖氨酸的添加浓度，相对于阴性实验组，密码子扩展系

统生产重组蛋白的效率有着显著的提升，证明了Pyl的从头合成途径产生的Pyl

可以被MbPylRS/tRNACUA对利用并掺入到报告基因中，另外赖氨酸的添加浓度

在超过20g/L时，对密码子扩展系统效率的提升已经没有明显效果。

为了生产ncAA修饰的Nisin突变体，对F44基因组上的nisZ基因进行敲

除，以快速定点突变的方法建立Nisin突变体质粒文库，对得到的变体进行发酵，

使用基于琼脂的延迟扩散试验测量Nisin变体的抗菌活性，但并未筛选到具有生

物活性的Nisin突变体，这可能是密码子扩展系统在F44中的效率低或者Nisin

变体的成熟过程受到影响导致的。

关键词：非天然氨基酸，终止密码子抑制，乳酸链球菌素，吡咯赖氨酰tRNA

合成酶

ABSTRACT

NisinisalantibioticproducedbycertainLactococcuslactisbacteria.Nisinis

alsooneofthefewantimicrobialpeptidesapprovedbytheFDAasafoodadditive

duetoitsbiosafety.ThelatestresearchalsofoundthepotentialofNisininanti-tumor

andanti-inflammatory.Thegeneticcodonexpansionmethodforsite-specificinsertion

ofnon-naturalaminoacids(ncAAs)intolivingcellproteinshasbeenwidelyusedin

recentyears.Thebiologicalsystemsinvolvedinthismethodincludebacteria,viruses,

andeukaryoticcells.ThesencAAscontainavarietyoffunctionalsidechain