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Ficoll密度梯度離心法分離外周血單核細胞(一)原理:紅細胞、粒細胞比重大，離心後沉於管底；淋巴細胞和單核細胞離心後漂浮於分層液的液面上，吸取分層液液面的細胞，就可從外周血中分離到單核細胞。(二)方法:1.在短管中加入適量細胞分離液。2.取肝素抗凝靜脈血，用滴管沿管壁緩慢疊加於分層液面上，注意保持清楚的介面。離心2000rpm×20分鐘。3.離心後管內分為三層，上層為血漿，下層主要為紅細胞和粒細胞。中層為淋巴細胞分離液，在上、中層介面處有一以單核細胞為主的白色雲霧層狹窄帶，單個核細胞包括淋巴細胞和單核細胞。4.用毛細血管插到雲霧層，吸取單個核細胞。置入另一短中管中，加入５倍以上體積的Hanks液或RPMI1640，1500rpm×10分鐘，洗滌細胞兩次。（三）等密度離心法概念：離心力作用下，不同密度的多組分顆粒在梯度介質中“向上”或“向下”移動，當移動至其密度與介質密度相等的位置便不再移動，形成靜止區帶，即達到離心平衡，各組分按密度不同處於區帶的不同位置。該離心方法稱等密度離心法。特點：（1）加样位置不拘。（2）离心平衡后，区带的位置、形状、不受离心时间影响。（3）梯度的密度范围应包括样品中所有组分颗粒之密度。（4）分离依据是颗粒组分间密度的差异，与颗粒大小，形状无关。（5）離心力大小，組分顆粒的大小和形狀，介質密度梯度的斜率和形狀，粘度影響離心時間和解析度。Percoll非連續等密度梯度離心法純化牛腎上腺嗜鉻細胞疼痛和帕金森病，體外無增殖能力，只能依賴於腎上腺髓質的分離來獲取。實驗動物年齡在1歲左右的健康小公牛，體重約200～400kg,取小公牛腎上腺，D-Hank’s溶液沖洗後，腎上腺充分消化後剝除皮質，將髓質剪碎成1mm左右的小塊，滴加少量DHank’s液以保持髓質的營養，將濾過的細胞懸液在100×g下離心8min，將細胞懸液離心後與密度為1.090g/ml的Percoll溶液混合，加入離心管底部，在其上分別緩慢加入密度為1.064g/ml、1.034g/ml、1.019g/ml的Percoll溶液，室溫下離心，200×g，20min。收集介於密度為1.064g/ml與1.034g/ml的兩層Percoll溶液介面之間的細胞，加入D-Hank’s液混懸後，在100×g下離心洗滌2次，每次8min。得細胞。五、密度梯度技術（一）密度梯度的作用:1.增加分離層次，提高解析度。2.防止溫差及振動造成的影響。（二）對密度梯度的基本要求1梯度介質應自身密度大，且溶解度足夠大，以便製作出密度範圍大的密度梯度。2理化性質穩定，生物惰性；離子強度低，滲透壓小，粘度小。3具某種可測性（如折射率）以測其濃度（密度），但不干擾分離組分的測定。4便於除去或回收。此外還有純度，價格等因素。(三)密度梯度的設計1梯度介質的選用:(1)鹽梯度介質(2)小分子有機物如蔗糖(3)三碘化苯衍生物(4)有機高聚物(5)膠態二氧化矽六:常見的密度梯度材料及應用⑴蔗糖：水溶性大，性質穩定，滲透壓較高，其最高密度可達1.33g/ml，且由於價格低容易製備，是現在實驗室裏常用於細胞器、病毒、RNA分離的梯度材料，但由於有較大的滲透壓，不宜用於細胞的分離。⑵聚蔗糖：商品名Ficoll，常採用Ficoll-400也就是相對分子重量為400000，Ficoll滲透壓低，但它的粘度卻特別高，為此常與泛影葡胺混合使用以降低粘度。主要用於分離各種細胞包括血細胞、成纖維細胞、腫瘤細胞、鼠肝細胞等。⑶氯化銫：是一種離子性介質、水溶性大，最高密度可達1.91g/ml。由於它是重金屬鹽類，在離心時形成的梯度有較好的解析度，被廣泛地用於DNA、質粒、病毒和脂蛋白的分離，但價格較貴。*幾種分子量測定方法的比較：離心技術第一節基本原理和設備一、沉降和離心沉降作用：懸浮液靜置時，在重力作用下，密度大於周圍溶液的固體顆粒逐漸下沉。漂浮作用：影響沉降的因素：顆粒大小、顆粒密度、溶液黏度離心技術:利用旋轉產生的離心力代替重力，加速固體沉降速度的一種分離方式。離心技術有多種形式：1．離心沉降2．離心過濾3．離心分離4．離心分析二離心力1離心力（centrifugalforce，Fc）：在一定角度速度下作圓周運動的任何物體都受到的向外的力。離心力（Fc）的大小等於離心加速度ω2r與顆粒品質m的乘積