沙质微泡菌脯氨酰寡肽酶异源表达与酶学特性研究.docxVIP

沙质微泡菌脯氨酰寡肽酶异源表达与酶学特性研究

目录

文档概要．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．3

1.1研究背景．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．4

1.2研究目的与意义．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．6

文献综述．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．8

2.1脯氨酰寡肽酶结构功能研究进展．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．9

2.2异源表达体系构建与应用概述．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．11

2.3精氨酸肽酶相关研究．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．13

实验材料与方法．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．14

3.1菌株、试剂与仪器．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．19

3.2基因克隆与原核表达载体制备．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．22

3.2.1目标基因PCR扩增．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．24

3.2.2表达载体pETXX构建．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．26

3.3重组PQ酶的大肠杆菌发酵与诱导表达．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．29

3.3.1细胞培养条件优化．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．32

3.3.2表达条件探索．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．33

3.3.3包涵体复性尝试．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．39

3.4重组PQ酶的分离纯化与活性测定．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．40

3.4.1包涵体裂解与蛋白变性处理．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．42

3.4.2利用离子交换单纯柱纯化目标蛋白．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．43

3.4.3酶活测定方法建立．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．45

3.5重组PQ酶酶学性质初步探究．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．49

3.5.1最适pH研究．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．51

3.5.2最适温度研究．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．52

3.5.3底物特异性分析．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．54

3.5.4主要抑制剂的效应测定．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．55

3.5.5温度稳定性测试．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．57

结果与分析．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．59

4.1目的基因的获取与序列分析．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．62

4.1.1PCR扩增结果．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．63

4.1.2基因序列鉴定．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．64

4.2表达载体pET-XX的构建与验证．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．66

4.3重组PQ酶在大肠杆菌中的表达情况．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．68

4.3.1SDSPAGE分析表达形式．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．69

4.3.2西门mo?eszne培养基中诱导表达量比较．．．．．．．．．．．．．．．．71

4.4重组PQ酶的纯化电泳分析．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．72

4.5纯化酶液的酶学基本参数测定．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．75

4.5.1比酶活测定值．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．77

4.5.2动力学参数估算．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．79

4.6pH对酶活及稳定性的影响．．．．．．．．．．．．．．．．．．．